ИЗВЕСТИЯ РАН. СЕРИЯ БИОЛОГИЧЕСКАЯ, 2010, № 6, с. 704-710
ФИЗИОЛОГИЯ ЖИВОТНЫХ И ЧЕЛОВЕКА
УДК 591.132.05+597
ДИНАМИКА АКТИВНОСТИ ПРОТЕИНАЗ И ГЛИКОЗИДАЗ ХИМУСА РЫБ ПРИ ЕГО ЭКСПОЗИЦИИ В ПРЕСНОЙ И СОЛОНОВАТОЙ ВОДЕ
© 2010 г. В. В. Кузьмина*, Н. В. Шеховцова**, В. Е. Болобонина*
*Институт биологии внутренних вод им. И.Д. Папанина РАН, 152742 Ярославская обл., Некоузский р-н, пос. Борок **Ярославский государственный университет им. П.Г. Демидова, 150027Ярославль, пер. Матросова, 9 e-mail: vkuzmina@ibiw.yaroslavl.ru Поступила в редакцию 13.08.2009 г.
Приведены результаты изучения активности протеиназ и гликозидаз содержимого кишечника (химуса) бентофага карася, содержавшегося на разных диетах, при его длительной экспозиции в воде. Установлено, что в процессе экспозиции химуса в воде уровень активности протеиназ снижается. Активность гликозидаз может возрастать, наиболее значительно в течение первых 3 сут экспозиции. Выявленный феномен позволяет предположить важную роль ферментов энтеральной микрофлоры в процессах деструкции белковых и углеводных компонентов взвеси и особенно детрита.
Начиная с конца ХХ в., особое внимание уделяется полифункциональности пищеварительной системы, выполняющей помимо трофической обменную, регуляторную, защитную и трансформационную функции у разных животных, в том числе и рыб (Уголев, 1985; Кузьмина, 1995, 1999; Buddington et al, 1997). В реализации большинства указанных функций важную роль играют пищеварительные гидролазы (Уголев, 1985; Кузьмина, 1995, 2005). Поскольку трансформационная функция пищеварительной системы рыб реализуется путем переноса вещества на новый трофический уровень, исследование ее масштабов традиционно связано с изучением активности ферментов, функционирующих в пищеварительном тракте рыб. Вместе с тем показано, что в диапазоне температур жизнедеятельности рыб активность ферментов химуса может сохраняться в течение длительного времени вне их организма (Кузьмина, 2010). Последнее дает основание считать, что трансформационная функция пищеварительных гидролаз рыб шире, чем предполагалось ранее. Действительно, попадая в составе экскрементов в воду, гидролазы пищеварительного тракта рыб могут играть важную роль в деструкции органических веществ, находящихся в воде, а, следовательно, и в функционировании водных экосистем. При этом важно отметить, что в полости кишечника рыб функционируют ферменты, синтезируемые не только поджелудочной железой и эпителиоцитами, но и энтеральной микробиотой (Лубянскене и др., 1989; Шивокене, 1989; Cahill, 1990; Clements 1997; Кузьмина, Скворцова, 2002; Кузьмина, 2005), а также экзоферменты, привносимые тканями
жертв (Уголев, Кузьмина, 1993; Кш'шта, Оо1о-уапоуа, 2004). Наиболее подробно у рыб разных видов исследована активность и характеристики протеиназ и гликозидаз слизистой оболочки кишечника. Вместе с тем известно, что энтеральная микробиота также синтезирует ферменты, обладающие протеолитической и амилолитической активностью (Лубянскене и др., 1989; Шивокене, 1989; СаЫ11, 1990; Кузьмина, Скворцова, 2002; Кузьмина, 2005). Поскольку активность ферментов рыб и их жертв со временем снижается, а микроорганизмы при соответствующих условиях могут существовать длительное время, можно предположить, что, попадая в воду в составе экскрементов, они, благодаря наличию широкого спектра гид-ролаз, могут продолжительное время осуществлять деструкцию органического вещества. При изучении активности протеиназ, функционирующих в толще воды Белого моря, было показано, что их роль в деструкции органического вещества особенно велика в верхнем 20-метровом слое воды (Агатова, Лапина, 2004). Глубина внутренних водоемов, как правило, не превышает 20 м. Следовательно, в большинстве пресноводных экосистем ферменты пищеварительного тракта рыб, в том числе энтеральной микробиоты могут функционировать не только в толще, но и в придонных слоях воды. Однако роль симбионтных микроорганизмов, обитающих в кишечнике рыб, в круговороте веществ в пресноводных водоемах практически не изучена.
Цель работы — изучение динамики активности протеиназ и гликозидаз, а также некоторых показателей микробиоты при экспонировании содержимого кишечника (химуса) карася, содержав-
шегося на разных диетах в пресной и солоноватой воде.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Работа проведена в течение 2008—2009 гг. Объект исследования — карась Carassius carassius (L.). Масса рыб — 22 ± 2 г. Кишечник сразу после вскрытия брюшной полости помещали на ледяную баню, очищали от жира, разрезали вдоль и изымали содержимое дистального отдела. Материал от 5 особей (без учета пола) объединяли и тщательно перемешивали. Для того, чтобы в разных опытах создать сопоставимые условия функционирования ферментов в воде, навески химуса гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе с небольшим количеством раствора Рингера для холоднокровных животных (103 мкМ NaCl, 1.9 мкМ KCl, 0.45 мкМ CaCl2, 1.4 мкМ MgSO4, рН 7) при температуре 0—4°С. Затем гомогенат разводили раствором Рингера до соотношения 1:9. После этого 5 мл тщательно перемешанного го-могената приливали к 45 мл водопроводной не-хлорированной воды (рН 7), или к 45 мл "солоноватой" воды — раствору Рингера (рН 7). В первом случае концентрация солей соответствовала 0.04, во втором — 6.3%о. Опыты проводили при температуре 20 ± 2С°. Определяли активность протеи-наз (в исходном гомогенате преимущественно активность трипсина, К.Ф. 3.4.21.4) и гликозидаз (в исходном гомогенате преимущественно активность а-амилазы КФ 3.2.1.1, глюкоамилазы КФ 3.2.1.3 и мальтазы КФ 3.2.1.20). Активность про-теиназ оценивали по приросту тирозина методом Ансона (Anson, 1938) в некоторой модификации, активность гликозидаз — по методу Уголева и Иезуитовой (1969). В качестве субстратов использовали 1%-ные растворы казеина и растворимого крахмала (рН 7.4), приготовленные на том же растворе Рингера. Перед взятием гомогената для определения ферментативной активности содержимое сосудов тщательно перемешивали. Время инкубации ферментативно активных препаратов и субстрата — 30 мин. Интенсивность окраски оценивали при помощи фотоколориметра КФК-2 (длина волны 587 нм). Активность ферментов в каждой временной точке определяли в шести по-вторностях с учетом фона (изначальное количество тирозина или гексоз в пробе). Одновременно отбирали материал для микробиологического анализа. Пробы замораживали и хранили при температуре —18°С. Определяли общую численность бактерий, численность сапротрофных и амилолитических бактерий (Нетрусов и др., 2005; Шеховцова, Верховцева, 1998). Для выявления различий в динамике численности сапротрофов использовали расчет удельной скорости ее снижения (тангенс угла наклона линии тренда для прологарифмированных значений численности).
Результаты обработаны статистически при помощи стандартного пакета программ (Microsoft Office XP приложение Excel) и приведены в виде средней ±SE. Достоверность различий оценивали при помощи критерия Стьюдента для малых выборок прир < 0.05.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Динамика активности протеиназ при экспонировании гомогената химуса карася в пресной и солоноватой воде. Уровень активности протеиназ химуса карася, содержавшегося на белковой и углеводной диетах, в пресной воде в начале экспозиции (нулевая точка) в значительной мере близок — 4.57 ± 0.34 и 4.93 ± 0.24 мкмоль/(г • мин) соответственно (рис. 1а). В течение экспозиции химуса в воде наблюдалось снижение ферментативной активности, достигающее к концу опыта 0.21 ± ±0.1 в случае белковой и 0.18 ± 0.08 мкмоль/(г • мин) в случае углеводной диеты. Однако на 3-и сут было выявлено достоверное (р < 0.05) увеличение протеолитической активности химуса рыб, содержавшихся на углеводной диете, до 1.51 ± 0.32, а на 4 и 7-е сут химуса рыб, получавших белковую пищу, до 0.88 ± 0.13 и 0.85 ± 0.07 мкмоль/(г • мин) соответственно.
Независимо от диеты, величина протеолити-ческой активности в случае химуса, помещенного в солоноватую воду, была ниже по сравнению с таковой химуса, помещенного в пресную воду. Изначально в солоноватой воде протеолитическая активность химуса рыб, содержавшихся на белковой или углеводной диете, находилась на одном уровне — 3.63 ± 0.09 мкмоль/(г • мин) (рис. 1б). В последующие сроки наблюдения активность протеиназ химуса рыб, получавших белковую диету, снижалась, достигая на 4-е сут 0.24 ± 0.1 мкмоль/(г • мин). На 5-е сут наблюдался достоверный подъем уровня протеолитической активности до 0.58 ± ± 0.18 мкмоль/(г • мин), затем недостоверные колебания уровня ферментативной активности, а на 8-е сут эксперимента был отмечен достоверный (р < 0.05) подъем величины показателя до 1.33 ± ± 0.51 мкмоль/(г • мин). Динамика протеолитиче-ской активности химуса рыб, содержавшихся на углеводной диете, значительно отличалась от вышеописанной. В начале опыта наблюдалось более резкое снижение ферментативной активности (до 0.73 ± 0.14 на 2-е сут), затем достоверное повышение на 3-и и особенно на 5-е сут до 1.36 ± 0.18 и достоверное понижение до 0.15 ± 0.08 мкмоль/(г • мин) на 8-е сут.
Таким образом, динамика протеолитической активности химуса рыб, содержавшихся на разных диетах, в пресной и солоноватой воде различна. При этом в пресной воде достоверное увеличение протеолитической активности химуса рыб, содержавшихся на белковой диете, наблюдается
мкмоль/(г ■ мин) 6
□ 2
(а)
I ш I I ш
1
012345678
-I
(б)
аШ
1Ш
iM
мкмоль/(г ■ мин) 40
20
il
□ 2
(а)
AlÛ
40
20
0123456789
*
(б)
и
±м
iM
*
J_SJ
012345678
Сутки
Рис. 1. Динамика протеолитической активности при экспонировании в пресной (а) и солоноватой (б) воде химуса карасей, содержавшихся на белковой (1) или углеводной (2) диете. По оси абсцисс — время экспозиции химуса, сут;
по оси ординат — активность протеиназ, мкмоль/(г ■ ■ мин); * — различия достоверны по сравнению с предыдущим сроком наблюдения (для рис. 1, 2).
на 4-е и 7-е сут, в солоноватой — на 8-е сут, химуса рыб, содержавшихся на углеводной диете — на 3-и, а также на 3-и и 5-е сут соответственно.
Динамика активности гликозидаз при экспозиции химуса карася в пресной и со
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.