ФИЗИОЛОГИЯ ЧЕЛОВЕКА, 2004, том 30, № 2, с. 110-116
УДК 612.111.12:546.17:613.165.6
ДИНАМИКА ОКСИГЕНАЦИИ НАТИВНОГО И УФ-МОДИФИЦИРОВАННОГО ГЕМОГЛОБИНА ЧЕЛОВЕКА В ПРИСУТСТВИИ ОКСИДА АЗОТА
© 2004 г. В. Г. Артшхов, Е. А. Калаева, О. В. Путинцева
Воронежский государственный университет Поступила в редакцию 13.08.2002 г.
Исследовано влияние нитрозогемоглобина (№N0) в диапазоне концентраций 0.1-10% на функциональные свойства нативного и УФ-облученного в дозах 151-453 Дж/м2 оксигемоглобина человека (НЬ02). Изучена динамика связывания кислорода гемопротеидом: показано, что присутствие ^N0 интенсифицирует начальные этапы процесса оксигенации и ослабляет кооперативные взаимодействия в тетрамерах, вследствие чего сродство гемоглобина к кислороду в области физиологически важных парциальных давлений (40-100 мм рт. ст.) снижается. Смеси НЬ02 и НЬН0 демонстрируют высокую устойчивость к воздействию "терапевтических" доз ультрафиолетового (УФ) света. Нелинейный характер зависимости изменений функциональной активности гемоглобина от концентрации №N0 в анализируемых образцах указывает на сложные взаимодействия компонентов смеси и образование продукта с новыми свойствами, отличными от таковых НЬ02 и №N0.
В 1980 г. Р.Ф. Фурчготт и Дж.В. Завадски предположили существование эндотелиального фактора релаксации сосудов, в 1987 г. этот фактор был идентифицирован как оксид азота [1]. Оксид азота (N0) выступает в качестве вещества, улучшающего микроциркуляцию за счет расслабления гладких мышц сосудов, изменения реологических свойств крови, процессов блокады агрегации тромбоцитов [2]. Синтез N0 в эндотелиальных клетках сосудов индуцируется целым рядом физиологических стимуляторов, в том числе изменением парциального давления кислорода (Р0 ) в крови [3].
В присутствии гемоглобина N0 активно связывается с ним [4], причем считается, что присоединение оксида азота может идти как по гемовой группе, так и по Ж-группам Cys93в [5]. Комплексы НЬ(Ре-К0), SN0-Hb, дезокси-НЬ являются эффективными регуляторами тонуса кровеносных сосудов [6] и снабжения тканей кислородом.
Таким образом, оксид азота играет важную роль в модуляции гемодинамики и оксигенации тканей и органов организма. Однако сообщения о влиянии N0 и ^N0 на кислородтранспортную функцию гемоглобина крайне противоречивы. Так, ингаляции N0 используют в медицине для усиления оксигенации у больных в состоянии острой гипоксии [7]. В то же время другие авторы считают, что образование N0 снижает кислородную емкость крови [8]. X. Косака и А. Сейяма [9] наблюдали у крыс, которым вводили нитроглицерин, сдвиг кривых диссоциации оксигемоглобина (КДО) вправо при концентрации ^N0 7-22
мМоль/л (в пересчете на мономеры); а К. Кон и соавт. [10], напротив, сообщали что в присутствии ^N0 в концентрации 1-5 мМоль/л происходит сдвиг КДО влево.
Полагают, что концентрация N0 играет роль в определении направления сдвига КДО [11], однако механизм, обусловливающий это явление, не выяснен.
В последнее время широкое применение в клинической практике находят немедикаментозные способы лечения, в том числе воздействие на организм человека различных диапазонов электромагнитного излучения. Распространение метода аутотрансфузии облученной ультрафиолетом (Уф-облученной) крови (АУФОК) обусловлено его положительными эффектами: улучшением реологических свойств крови, усилением оксигенации, бактерицидным действием, нормализацией иммунологических показателей и др. Комплекс НЬ-К0, вероятно, играет определенную роль в проявлении лечебного действия АУФОК-терапии, особенно на уровне микроциркулятор-ного русла. Однако возможный вклад минорных дериватов гемоглобина (в частности, ^N0) в формирование этих эффектов не установлен.
В связи с вышеизложенным значительный теоретический и практический интерес представляют исследования по анализу влияния различных концентраций N0 и "терапевтических" доз УФ-радиации на функциональные свойства гемоглобина человека, что и явилось основной целью настоящего сообщения.
МЕТОДИКА
Оксигемоглобин (HbO2) выделяли из эритроцитов крови доноров методом Д. Драбкина [12] с модификациями Л.А. Блюменфельда [13], в основе которого лежит осмотический гемолиз эритроцитов.
HbO2 переводили в нитрозоформу, применяя в качестве донора оксида азота нитрозоцистеин (Cys-NO), который получали по методу, описанному в работе А. А. Монгина и соавт. [14]. Для этого на влажном льду смешивали эквимолярные количества L-цистеина и нитрита натрия (NaNO2), затем добавляли соляную кислоту (0.5 Моль/л); при этом раствор приобретал красную окраску и максимумы светопоглощения при 340 и 540 нм. Раствор Cys-NO хранили в темноте на льду не более 1 часа и непосредственно перед использованием нейтрализовали гидроксидом натрия.
В колбу с боковым отростком вносили 1.5 мл раствора HbO2 в концентрации 10-4 Моль/л, в боковой отросток - 0.7 мл раствора Cys-NO (0.1 Моль/л). Содержимое колбы вакуумировали в течение 20 мин, снижая давление до 10-4 мм рт. ст. После этого к раствору образовавшегося дезокси-генированного гемопротеида приливали Cys-NO и инкубировали смесь при вакуумировании 10 мин. От избытка несвязавшихся молекул Cys-NO избавлялись, пропуская раствор гембелка через хроматографическую колонку (высота - 70 мм, диаметр - 10 мм), упакованную сефадексом G-25 ("Pharmacia", Швеция) и уравновешенную Na-фо-сфатным буфером (0.1 Моль/л, pH 7.4). Образование нитрозогемоглобина контролировали спект-рофотометрически по наличию характерных максимумов поглощения (418, 545 и 575 нм).
Растворы гембелка в объеме 3 мл облучали светом ртутно-кварцевой лампы типа ДРТ-400 в термо-статируемой кювете (20 ± 1°С) на расстоянии 23 см от оси лампы при постоянном перемешивании магнитной мешалкой. Интегральный поток УФ-излу-чения выделяли с помощью светофильтра УФС-1 (полоса пропускания - 240-390 нм). Интенсивность облучения составляла 151 Дж/(м2 мин). Время экспозиции - 1 и 3 мин, что соответствовало дозам облучения 151 и 453 Дж/м2.
Для регистрации кривых диссоциации гемопротеида использовалась установка, изготовленная на кафедре биофизики и биотехнологии Воронежского госуниверситета [15], принцип действия которой основан на линейной связи между степенью насыщения гемоглобина кислородом и изменением его спектральных характеристик.
Степень перехода оксиформы в дезоксиформу гембелка контролировали спектрофотометриче-ски, используя соотношение оптических плотностей при длинах волн 555 и 540 нм [16].
Парциальное давление кислорода в тонометре рассчитывали по формуле:
Ро2 = Рвозд^/100,
где Ро - парциальное давление кислорода, мм рт. ст.; Рвозд - давление воздуха в тонометре, мм рт. ст.; ^ - содержание кислорода в воздухе, %.
Степень насыщения гемоглобина кислородом (У) вычисляли по уравнению:
Y = % HbO2 =
AHb — Ax
AHb - AHbO,
где AHb - оптическая плотность дезоксигемогло-бина; AHbO - оптическая плотность раствора ок-сигемоглобина; Ax - оптическая плотность раствора гемоглобина при данном давлении.
При построении кривых диссоциации оксиге-моглобина по оси абсцисс откладывали парциальное давление кислорода в мм рт.ст., а по оси ординат - насыщение гемоглобина кислородом в процентах.
Традиционным критерием оценки функциональной активности гемоглобина является величина давления полунасыщения белка лигандом -P50 (парциальное давление кислорода, при котором половина всех гемов в тетрамере связана с кислородом). Однако анализ кислородтранспорт-ной функции смесей различных форм гемопротеида по одной точке не вполне правомочен и недостаточно информативен, поскольку не учитывает сложного характера взаимодействий дериватов гемоглобина между собой и не позволяет выявить, в какой фазе оксигенации происходят те или иные изменения. Поэтому был произведен расчет содержания оксигемоглобина в интактном образце и смесях при различных парциальных давлениях кислорода: 3.19; 7.98; 15.96; 23.94; 31.92; 63.84; 95.76 мм рт. ст.
Статистическую обработку результатов исследования проводили с помощью пакета прикладных программ "Stadia". Достоверность различий контрольных и опытных значений сравниваемых показателей определяли по i-критерию Стьюдента. Кластерный анализ проводили с использованием метрики корреляции, стратегия классификации - группового соседа [17].
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В качестве контрольных нами были зарегистрированы кривые диссоциации нативного оксигемоглобина человека (10-5 Моль/л).
Было обнаружено, что функция насыщения гемоглобина кислородом подчиняется ^-образной зависимости, а на графике можно условно выделить 3 фазы процесса оксигенации (рис. 1, А).
%
90 70 50 30 10
А
10 30
50
%
80 60 40 20
Б
70 90 мм рт. ст.
10 30
50
90 110
мм рт. ст.
Рис. 1. Кривые диссоциации нативных и УФ-облученных образцов оксигемоглобина человека (А) и смеси 0.1% нит-розогемоглобина и 99.9% оксигемоглобина (Б).
1 - необлученный образец; 2 - облучение в дозе 151 Дж/м2; 3 - облучение в дозе 453 Дж/м2.
По оси абсцисс - парциальное давление кислорода (Р0 ), мм рт. ст.; по оси ординат - концентрация оксигемоглобина в образце, %.
Первая фаза приходится на начало кривой (Р о < 10 мм рт. ст.), когда степень оксигенации
гемоглобина мала вследствие наличия стеричес-ких препятствий для проникновения 02 в полость гемового кармана, и вероятность того, что кислород связывается одновременно с двумя и более темами, очень низка. На этой стадии у большинства тетрамеров в оксигенацию включается по одному активному центру, которые связывают по одной молекуле 02.
Во второй фазе процесса (10 < Р о < 40 мм рт. ст.) с увеличением парциального давления 02 число тетрамеров, присоединивших более одной молекулы лиганда, растет непропорционально росту Р0 , и появляются полностью насыщенные
кислородом белковые макромолекулы. На этом этапе оксигенации проявляется кооперативный эффект, заключающийся в том, что внутри тет-рамера происходит взаимодействие гемовых групп, и присоединение лиганда к одной из них изменяет сродство к кислороду у остальных. Кривая диссоциации при этом приобретает крутой изгиб вверх, в область больших насыщений гемоглобина кислородом.
Дальней
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.