МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2014, том 48, № 2, с. 306-313
МОЛЕКУЛЯРНАЯ ^^^^^^^^^^^^ БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ
УДК 577.21
ДИНАМИКА ОТВЕТА НА ТЕПЛОВОЙ ШОК ПРИ НАРУШЕНИИ ДЕЙСТВИЯ ОСНОВНОГО ФАКТОРА ТРАНСКРИПЦИИ (HSF)
© 2014 г. С. Ю. Фуников*, Д. Г. Гарбуз, О. Г. Зацепина
Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук, Москва, 119991
Поступила в редакцию 26.09.2013 г. Принята к печати 07.11.2013 г.
Экспрессия генов hsp регулируется универсальным фактором транскрипции теплового шока (HSF). Термочувствительная линия hsf4 Drosophila melanogaster, мутантная по гену hsf, характеризуется отсутствием индукции всех генов hsp в ответ на тепловой шок. В представленной работе показано, что физиологическая функция HSF4, несмотря на ее подавление в результате теплового шока, не утрачивается полностью и со временем восстанавливается даже после сильного теплового воздействия. Проанализирована динамика накопления и деградации продуктов генов hsp на транскрипционном и трансляционном уровне. Показано, что индукция генов hsp, особенно гена hsp68, у мух мутантной линии происходит слабее, чем в контрольной линии с геном hsf дикого типа. Таким образом, несмотря на то, что HSF4 вызывает отсроченную активацию генов hsp, ответ линии hsf4 на тепловой шок остается неполноценным.
Ключевые слова: Drosophila melanogaster, ответ на тепловой шок, транскрипция, фактор транскрипции теплового шока, трансляция, ДНК-связывающая активность.
KINETICS OF HEAT SHOCK RESPONSE UPON DISFUNCTION OF GENERAL TRANSCRIPTION FACTOR (HSF), by S. Yu. Funikov*, D. G. Garbuz, O. G. Zatsepina (Engelhardt Institute of Molecular Biology, Russian Academy of Sciences, Moscow, 119991 Russia; *e-mail: sergeifunikov@mail.ru). The heat shock transcription factor (HSF) is a universal activator of hsp gene expression in eukaryotes. A temperature sensitive Drosophila melanogaster strain (hsf4) with a mutation in the hsfgene was originally described as a strain lacking the transcription of hsp genes in response to heat shock. Our results demonstrated that physiological function of HSF4 is not fully abrogated after heat exposure and is able to recover even after severe heat stress, causing the induction of hsp gene expression. We have studied the kinetics of accumulation and degradation of hsp gene products at transcriptional and translational levels and shown that induction of hsp genes, particularly hsp68, in mutant strain is weaker than that in the wild type. Thus, despite the fact that the HSF4 causes a delayed activation of hsp, response to heat shock in hsf4 strain remains defective.
Keywords: Drosophila melanogaster, heat shock response, transcription, heat shock transcription factor, translation, DNA-binding activity.
Б01: 10.7868/80026898414020050
Способность организма отвечать на воздействие теплового шока (ТШ) проявляется активацией специальных генов, которые кодируют высококонсервативные белки, называемые белками теплового шока (ЖР), и представляет собой универсальный механизм, описанный у всех живых организмов — от бактерий до человека [1, 2]. И8Р выполняют функцию молекулярных шаперонов, они предотвращают агрегацию денатурированных белков, помогают восстанавливать третич-
ную структуру белков или направляют их на путь протеолитической деградации в протеасомы [3, 4]. Сигналом для активации генов Нзр может служить не только ТШ, но и любое воздействие, приводящее к нарушению конформации белков внутри клетки, в том числе, аноксия, окислительный стресс, повреждение клетки вследствие ишемии или инфекции. В некоторых случаях активация генов Нзр происходит при пролиферации и делении клеток [1, 5].
Принятые сокращения: HSP — белок теплового шока (Heat Shock Protein); HSF — фактор транскрипции теплового шока (Heat Shock transcription Factor); ТШ — тепловой шок; HSE — элемент теплового шока (Heat Shock Element); hsf4 — линия Drosophila melanogaster с мутацией в гене hsf; HSF4 — мутантный фактор HSF.
* Эл. почта: sergeifunikov@mail.ru
Синтез HSP регулируется на уровне транскрипции и трансляции [1]. Центральное звено в регуляции транскрипции — действие стресс-ак-тивируемого белкового фактора теплового шока (HSF) [6]. В клетках Drosophila в отсутствие стресса HSF находится в виде мономера в комплексе с HSP, не проявляя транскрипционной активности. При ТШ, благодаря большему сродству HSP к денатурированным белкам, комплекс разрушается, что приводит к активации HSF [7—9]. HSF образует тример, фосфорилируется, связывается со специфичной нуклеотидной последовательностью (HSE, heat shock element) в промоторных областях генов hsp и запускает их транскрипцию [10-12].
В 1997 году Jedlicka и соавт. [13] удалось получить термочувствительную линию D. melanogaster (hsf4) с мутацией в гене hsf, которая приводит к полной потере ДНК-связывающей активности при температуре выше 33°C и, соответственно, к отсутствию синтеза HSP, в частности, главного стрессового белка HSP70 [13].
Линия hsf4 активно используется для исследования физиологической функции HSF в регуляции транскрипции генов hsp при ТШ, формирования термотолерантности, а также при изучении феномена гормезиса [14-20]. Неожиданно оказалось, что у мух линии hsf4 во время периода восстановления после ТШ происходит накопление HSP70 [17]. Также было показано, что при определенных условиях температурного воздействия у мух линии hsf4 индуцируются hsp и сохраняется относительно высокая устойчивость к ТШ [18]. Однако до сих пор неясно, связана ли активация генов hsp с восстановлением функции HSF4 или индукция генов hsp в линии hsf4 обусловлена действием других факторов транскрипции, частично компенсирующих физиологическую функцию HSF.
Анализируя экспериментальные данные, полученные при работе с линией hsf4, мы предположили, что, несмотря на подавление ДНК-связы-вающей активности HSF4 во время ТШ, его физиологическая функция не исчезает полностью и, восстанавливаясь со временем, активирует синтез HSP.
В данной работе нами впервые показано восстановление ДНК-связывающей активности HSF4 после ТШ, а также изучена кинетика ответа на ТШ у мух линии hsf4 на транскрипционном и трансляционном уровне.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Линии D. melanogaster и условия постановки экспериментов по воздействию ТШ. Термочувствительная линия hsf4 (cn[1] bw[1] hsf[4]) [13] и линия hsf4, трансформированная геном hsf дико-
го типа (cn[1] hsf[4] bw[1]; p{w[+mC] = = hsf[+t8]}1/TM3, sb[1] ser[1]), обозначенная здесь как hsf4+, получены из Bloomington Drosophila Stock Center, США. В линии hsf4 высококонсервативный остаток валина в ДНК-связывающем домене HSF заменен на остаток метионина (Val57Met). Лабораторная линия df (df(1)w, yw67c23(2)) использована в качестве контроля.
Мух выращивали при 25 °C на стандартном (сахар/дрожжи/агар) корме, содержащем пропионо-вую кислоту в качестве ингибитора роста плесени. В опытах по изучению ответа на ТШ отбирали взрослых одно- и двухдневных мух и помещали их в герметично закрытую 50 мл пластиковую пробирку. Затем пробирку опускали в водяную баню и выдерживали определенное время при определенной температуре в зависимости от опыта.
Анализ сдвига электрофоретической подвижности в геле (гель-шифт анализ). Для выявления момента связывания HSF с промотором мух подвергали ТШ в течение 20 мин при 36°C. Затем через 0, 20, 40, 60 и 90 мин после ТШ (время восстановления) из них получали белковые экстракты и проводили гель-шифт анализ согласно [13]. В опытах по связыванию HSF с HSE использовали меченный [a32-P] dATP двухцепочечный фрагмент ДНК (5'-ATCCGAGCGCGCCTCGGAAT-GTTCTAGAA-3', 5' - ACCTTTTCTAGAACATTC -CGAGGCGCGCTC-3'), содержащий канонический HSE-сайт. Для выявления специфичности связывания HSF-HSE использовали поликло-нальные кроличьи антитела, любезно предоставленные проф. С. Wu. После реакции связывания, пробы электрофоретически разделяли в 4.5%-по-лиакриламидном геле (ПААГ). Высушенный гель экспонировали с рентгеновской пленкой.
Количественная ПЦР в реальном времени. Для
определения относительного количества мРНК генов hsp мух подвергали воздействию ТШ в течение 30 мин при 37°C. Контрольных мух содержали при 25 °C. Суммарную РНК выделяли с помощью Tri-reagent ("Sigma-Aldrich", США) через 0, 1, 2, 3, 4, 6, 8 и 12 ч после ТШ и обрабатывали ДНКазой I ("Sigma-Aldrich", США). Для синтеза кДНК использовали 1 мкг суммарной РНК, дека-нуклеотидные праймеры и обратную транскрип-тазу из набора MMLV Reverse Transcriptase Kit ("Евроген", Россия).
Анализ проводили на приборе ABI PRISM® 7500 Sequence Detection System, ("Applied Biosystems", США). Продукты амплификации выявляли с помощью интеркалирующего красителя SYBR Green I в присутствии референсного красителя ROX ("Евроген", Россия) согласно рекомендациям производителя. Уровень мРНК нормировали относительно генов rpl32 (рибосомный белок L32) и ef1a (фактор элонгации 1a) и определяли по методу AACt.
л ч
о &
Я
о
а
О
О
О
В
н
о ч о О
с
CN
О
«
и
я
и
^
О
HSP70
Актин 5 с
Рис. 1. Вестерн-блотинг белковых экстрактов из линии hsf4 DrosophUa melanogaster выявляет отсутствие накопления Н8Р70 сразу после ТШ при 36, 37 и 38.5°С. У мух линии hsf4 Н8Р70 накапливается спустя 24 ч после воздействия сильным ТШ (38.5°С). Для
4+
сравнения взята линия hsf
В работе использовали праймеры к генам: hsp70 5'-GCTAAACAATCTGCAATAAAGTG-3', 5'-CAT-TGTGTGTGAGTTCTTCTTC-3'; hsp68 5'-CCT-GATTGGGCGTCGTTTC-3', 5'-GCAGTCTCCT-TCATTTTGGT-3'; hsp83 5'-CGATTAAGCGAC-CAGTCGAA-3', 5-AAACGACAACTGCTCTTGAATG-3'; dnaj-1 5'-CATAAAGCAGCCCGTGTAGC-3', 5' -AGATGTTGAGGCACCGATTC-3'; ef1a 5'-GCGTGGGTTTGTGATCAGTT-3', 5'-GATCT-TCTCCTTGCCCATCC-3'; rpl32 5'-ATGCTAAGCT-GTCGCACAAAT-3', 5'-GTTCGATCCGTAAC-CGATGT-3'. Праймеры для гена hsp70 были подобраны таким образом, чтобы они соответствовали нуклеотидным последовательностям 5'-нетранс-лируемых областей всех шести генов hsp70D. mela-nogaster. Эффективность реакции, определенная для каждой пары праймеров, составила не менее 95%.
Вестерн-блотинг. Белковые экстракты из мух, подвергнутых ТШ (30 мин, 37°C), получали в определенные промежутки времени (0, 1,
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.