НЕЙРОХИМИЯ, 2010, том 27, № 2, с. 144-149
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ^^^^^^^^^^^^ РАБОТЫ
УДК 577.352
ДИНАМИКА ПЕРЕКИСНОГО ОКИСЛЕНИЯ ЛИПИДОВ МЕМБРАН ГИППОКАМПА У НЕ- И ПРЕКОНДИЦИОНИРОВАННЫХ КРЫС ПОСЛЕ ТЯЖЕЛОЙ ГИПОБАРИЧЕСКОЙ ГИПОКСИИ
© 2010 г. М. С. Кислин, Е. И. Тюлькова*, М. О. Самойлов
Учреждение РАН Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН, Санкт-Петербург
Исследовано влияние тяжелой гипобарической гипоксии и последующей реоксигенации на уровень и динамику перекисного окисления липидов мембран клеток гиппокампа непрекондициони-рованных и прекондиционированных умеренной гипобарической гипоксией крыс. Показано, что гипоксическое прекондиционирование, повышающее резистентность мозга, в значительной мере предотвращает вызываемые тяжелой гипоксией нарушения процессов перекисного окисления ли-пидов в гиппокампе — одном из наиболее чувствительных к гипоксическим воздействиям образований мозга.
Ключевые слова: прекондиционирование, тяжелая гипобарическая гипоксия, реоксигенация, перекисное окисление липидов, гиппокамп.
Особое место среди различных видов адаптивных реакций нервной системы занимают те, которые развиваются в ответ на действие экстремальных факторов среды (высотная гипоксия, гипероксия, тепловой шок, стрессорные и токсические воздействия). В центральной нервной системе ряд ферментов, включающих митохондриальные оксида-зы, ксантиноксидазу, миелопероксидазы, цитохром Р450 цитоплазмы и моноаминоксидазу, циклоокси-геназы (СОХз), липооксигеназы (ЬОХз), МО-синта-зу и МАЭРИ-оксидазу плазматической мембраны, утилизируют молекулярный кислород, продуцируя свободные радикалы в нормальных физиологических условиях [1]. Свободные радикалы способны инициировать и активировать процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ), являющиеся одним из механизмов, ответственных за модификацию состава и физико-химических свойств мембран, с которыми связаны практически все процессы, протекающие в образованиях центральной нервной системы, определяющие ее чувствительность к внешним и внутренним факторам. Изменение уровня ПОЛ характерно для многих физиологических реакций. При физиологических условиях ПОЛ участвует в поддержании структурной целостности, функциональной пластичности мембран и в обеспечении работы ионных каналов, рецепторов и ферментов. Важная роль ПОЛ отводится в механизмах синаптической пластичности и процессах памяти [2]. Уровень ПОЛ зависит от свойств и соотношения про- и антиокси-
*Адресат для корреспонденции: 199034, Санкт-Петербург, наб. Макарова. д.6, тел. (812)595-30-36 (доб. 331), e-mail: anoxia@pavlov. infran.ru
дантных систем и полноценно отражает функциональное состояние ткани в каждый конкретный момент, ее адаптивные возможности, а также состояние пластичности ее мембран. Различные патологические воздействия способны нарушать функционирование ряда ферментов и, как следствие, изменять уровень свободных радикалов в клетках центральной нервной системы. Показано, что гиперактивация прооксидантных систем, приводящая к выраженным нарушениям свободнорадикального окисления липидов нейрональных мембран, вовлекается в механизмы ряда постстрессорных и нейро-дегенеративных патологий [3—6].
Тяжелая гипобарическая гипоксия — это мощное стрессорное воздействие, которое индуцирует изменения функционального состояния нейронов мозга и целый ряд молекулярно-клеточных нарушений, среди которых, согласно современным представлениям, прежде всего следует отметить эффекты, вызванные сильным повышением внутриклеточной концентрации ионов Са2+ [7, 8], обусловленное гиперактивацией ММПА-рецепторов [9—11]. Полагают, что резкое увеличение содержания внутриклеточного кальция играет одну из ключевых ролей в запуске каскада молекулярно-кле-точных механизмов, в том числе с участием фосфо-инозитидной [12] и прооксидантной систем [13]. Как показано в наших работах, тяжелая гипобарическая гипоксия приводит к подавлению экспрессии ряда транскипционных факторов (МОР1-А, с-Ро8, рСЯББ, МР-кБ), а так же антиапоптотических белков Вс1-2, Бс1-хЬ, и активации экспрессии проапо-птотических факторов (Бах, ЖК, р38, рс-.щп) в гиппокампе и неокортексе крыс [14—19]. Наряду с этим
тяжелая гипобарическая гипоксия вызывает отсроченные структурные повреждения нейронов этих образований мозга по типу апоптоза [15, 17]. Эти молекулярные и структурные нарушения, вызванные тяжелой гипобарической гипоксией и в значительной мере связанные с последствиями увеличения концентрации ионов Са2+ в цитоплазме и окси-дативным стрессом, находят свое отражения в расстройствах ряда поведенческих реакций, а также обучения и памяти [16, 20, 21].
В качестве немедикаментозных способов повышения устойчивости структур головного мозга могут быть использованы краткосрочные или умеренные (сублетальные) экстремальные воздействия, мобилизирующие эволюционно сложившиеся и генетически детерминированные механизмы приспособительных реакций, направленные на повышение устойчивости к возможному последующему повреждающему действию неблагоприятных факторов среды, таких как тяжелая гипобарическая гипоксия [22]. Гипоксическое прекондиционирова-ние нейронов мозга является одним из видов приспособительных реакций к ряду неблагоприятных факторов [23—27].
Цель настоящей работы — сравнение динамики ПОЛ в гиппокампе непрекондиционированных и прекондиционированных крыс в различные периоды времени после предъявления тяжелой гипобари-ческой гипоксии.
МЕТОДИКА
Эксперименты проведены с соблюдением правил работы с животными, опубликованными Международным обществом по нейронаукам ("Guidelines for the Use ofAnimals in Neuroscience Research", Membership Directory of the Society, 1992) на крысах-самцах линии Вистар (весом 200—220 г), которые подвергались гипобарической гипоксии в различных режимах в барокамере проточного типа при температуре 20—22°С.
Первую группу экспериментальных животных подвергали тяжелой гипобарической гипоксиии (3 часа в барокамере при 180—200 мм рт. ст., что соответствует подъему на высоту 10—11 км), а вторую группу за 24 ч до данного воздействия подвергали прекондиционирующим умеренным гипоксиче-ским воздействиям (трехкратно по 2 ч с 24-часовым интервалом при 360 мм рт. ст., что соответствует подъему на высоту 5 км). Выживаемость крыс после 3-часовой тяжелой гипобарической гипоксии составляла около 50%. Выбранный режим преконди-ционирования в среднем увеличивал выживаемость до 85%. В качестве контроля для первой группы экспериментальных животных использовали крыс, которых помещали в барокамеру на 3 ч при нормальном атмосферном давлении, а крыс второй группы помещали в барокамеру на соответствую-
щие экспериментальной группе сроки (трехкратно по 2 ч с 24-часовым интервалом при 750— 770 мм рт. ст.).
Животных декапитировали сразу же после воздействия, через 3 ч и через 1 сут. Из головного мозга извлекали гиппокамп. Все процедуры проводили на холоду. Ткань гиппокампа гомогенизировали:
А) в смеси хлороформ—метанол (2 : 1);
Б) в водном буфере, содержащем 30мМ трис-HCl, 100мМ KCl, (pH = 7.4)
Из гомогенатов гиппокампа, полученных в смеси хлороформ — метанол (2 : 1), экстрагировали ли-пиды по методу Фолча [28]. Экстракт отмывали от ганглиозидов и нелипидных примесей один раз — охлажденным 0.09% NaCl, и дважды — смесью мета-нол—Н20—хлороформ (47 : 48 : 3).
Количество липоперекисей определяли колориметрическим методом с использованием хлористого алюминия [29], диеновых и триеновых конъюга-тов — спектрофотометрически при 233 и 274 нм соответственно [30]. Кроме того, регистрировали оптическую плотность липидного экстракта при 215 нм и рассчитывали индекс Клейна, характеризующего степень окисленности липидов. Флюори-метрическим методом определяли содержание шиффовых оснований (ОШ) при максимуме возбуждения 365 нм и максимуме испускания 425 нм [31]. Результаты выражали в условных единицах (единицах экстинкции или флуоресценции) в расчете на 1 мг фосфолипидов. Количество фосфоли-пидов оценивали (спектрофотометрически при 830 нм) по содержанию "неорганического" фосфора методом Бартлетта [32].
В гомогенатах гиппокампа, приготовленных на водном буфере, определяли содержание продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой (ТБКАП), фотометрируя образцы при 532 нм
[33]. Также учитывался вклад неспецифического поглощения (светорассеяния), который оценивался по величине оптической плотности при 600 нм
[34]. Содержание ТБКАП выражалось в условных единицах на 1 мг белка [35].
Все полученные результаты обрабатывали статистически по правилам вариационной статистики [36]. Различия между величинами считали достоверными при p = 0.05.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Результаты исследования представлены в виде гистограмм на рис. 1, 2 для гиппокампа непрекон-диционированных и прекондиционированных крыс соответственно. Контрольные значения принимали за 100%.
Гиппокамп непрекондиционированных животных. В результате трехчасового гипоксического воздействия резко изменялась степень окисленности ли-пидов мембран, которая оценивалась по коэффи-
146
200
180
160
140
«
л о 120
&
н о 100
к
н
о 80
60
40
20
0
КИСЛИН и др.
Гиппокамп непрекондиционированных крыс
коэф. Клейна
□ ДК
□ ТК □ ЛП □ ТБКАП □ ОШ
Рис. 1. Динамика изменения содержания продуктов ПОЛ в гиппокампе непрекондиционированных крыс сразу после (0), через 3 и 24 ч после тяжелого гипоксического воздействия, где ДК — диеновые конъюганты, ТК — триеновые конъ-юганты, ЛП—липоперекиси, ТБКАП — тиобарбитуровой кислоты активные продукты, ОШ — основания Шиффа.
циенту Клейна, увеличившемуся на 70% по сравнению с контролем. Так же за время воздействия значительно увеличилось содержание диеновых и триеновых конъюгатов (на 57 и на 34% соответственно). Однако через 3 и через 24 ч после гипо-ксического воздействия достоверные различия в коэффициенте Клейна и в уровне диеновых и триеновых конъюгатов не выявлены. Количество липо-перекисей под влиянием гипобарической гипоксии также значительно увеличивалось (на 50%), но через 3 ч после воздействия наблюдалось снижение на 30% по сравнению с контролем, а через 1 сут отмечено лишь незначительное увели
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.