БИОЛОГИЯ ВНУТРЕННИХ ВОД, 2012, № 2, с. 70-76
ВОДНАЯ ТОКСИКОЛОГИЯ
УДК 591.524.12.044:597.554.3
ДИНАМИКА ПРОЦЕССОВ АНТИОКСИДАНТНОЙ ЗАЩИТЫ И ДЕТОКСИКАЦИИ В ПЕЧЕНИ КАРПОВЫХ РЫБ ПРИ ДЕЙСТВИИ СТРОБИЛУРИНОВЫХ ФУНГИЦИДОВ © 2012 г. И. Л. Левина, Е. А. Федорова, Л. Я. Кузнецова, О. А. Зинчук
Азовский НИИ рыбного хозяйства, 344002 Ростов-на-Дону, ул. Береговая, 21/в, e-mail: ir_lev@rambler.ru Поступила в редакцию 04.02.2011 г.
Изучено влияние трех фунгицидов нового поколения — стробилуринов — на сеголетков карпа. Показано, что при остром действии (96 ч) они особо токсичны для рыб. Фунгициды в минимальных летальных концентрациях (ЛК^) вызывали нарушения про/антиоксидантного баланса и активацию детоксикационных процессов в печени карпа уже в начальные сроки интоксикации (24—96 ч). Увеличение экспозиции приводило к интенсификации перекисного окисления липидов с одновременным ослаблением эффективности антиоксидантной защиты и детоксикации. Отмечено инги-бирование активности супероксиддисмутазы, каталазы, глутатион-$-трансферазы, истощение запасов восстановленного глутатиона. В результате развития интоксикации к концу эксперимента (15 сут) зарегистрированы морфофункциональные изменения в печени и гибель 49% рыб.
Ключевые слова: стробилурины, токсичность, перекисное окисление липидов, ферменты антиоксидантной защиты, детоксикация, эстеразы, глутатионовая система.
ВВЕДЕНИЕ
Повышение эффективности сельскохозяйственного производства неразрывно связано с применением пестицидов, которые целенаправленно синтезируются, преднамеренно вносятся в окружающую среду и способны оказывать негативное влияние на водные экосистемы. Для современного этапа разработки пестицидов характерен поиск препаратов, обладающих высокой активностью в низких нормах расхода. Это прежде всего пестициды с новыми механизмами действия. Перспективная область в химии фунгицидов — поиск ингибиторов транспорта электронов в митохондриях патогенов. В этой связи наибольший интерес имеет новый эффективный класс химических соединений — стробилурины, представляющие четвертое поколение фунгицидов [3, 5].
По химической классификации это сложные гетероциклические соединения с несколькими ге-тероатомами в циклах, представляют собой эфиры замещенной р-метоксиакриловой кислоты и ее аза-аналогов. Структурно они родственны стро-билурину А, выделенному из различных видов грибов. Механизм действия стробилуринов для патогенных организмов заключается в подавлении митохондриального дыхания в грибах путем блокировки перемещения электронов в цитохро-мах Ь и с дыхательной цепи [6].
По параметрам острой и дермальной токсичности стробилурины малотоксичны для млекопитающих и отнесены к классу опасности IV [18]. Современные данные, оценивающие токсические свойства стробилуриновых фунгицидов для гидро-бионтов, очень ограничены. Ранее показано, что в отличие от млекопитающих водные организмы чрезвычайно чувствительны к действию стробилу-риновых фунгицидов. Наиболее уязвимыми были эмбрионы и предличинки осетровых рыб, ветви-стоусые рачки дафнии. У них отмечались необратимые физиологические нарушения, связанные с развитием, ростом и репродукцией, в растворах с низкими концентрациями фунгицидов [4, 24]. Поступая в водоемы с поверхностным стоком из сельскохозяйственных источников, стробилурины могут оказывать влияние и на структурно-метаболические процессы у рыб.
Цель работы — изучение интенсивности процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ), антиоксидантной защиты и детоксикации в печени карповых рыб при интоксикации стробилури-нами.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Исследования проводили на сеголетках карпа (Сурппш еагрю Ь). По 10 экз. рыб длиной 18—20 см и массой 40—50 г без травм, признаков истощения
Таблица 1. Токсикометрические параметры стробилуринов для сеголетков карпа в острых опытах при экспозиции 96 ч, мг/л
Токсикометрический
Пестициды
параметр Димоксистробин Трифлоксистробин Пираклостробин
ЛК) 0.022 0.056 0.014
ЛК16 0.029 0.073 0.024
ЛК50 0.039 0.090 0.042
и патологии помещали в 50-литровые аквариумы с отстоянной аэрируемой водопроводной водой. В работе использованы три технических продукта (содержание действующего вещества в каждом >95%) — фунгициды Трифлоксистробин, Пирак-лостробин и Димоксистробин ("Байер КропСай-енс АГ", Германия). Фунгициды умеренно стабильны в водной среде, период их 95%-ного распада (т95%) 56—57 сут. Из-за низкой растворимости в воде (0.6—4.3 мг/л) их навески предварительно растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО). Полученные растворы вносили однократно в опытные аквариумы, создавая необходимые концентрации в воде. Конечные концентрации ДМСО не превышали его ПДК, равного 10 мг/л для воды ры-бохозяйственных водоемов, и были безвредны для рыб [17]. В течение эксперимента регистрировали клинические признаки отравления рыб. Токсико-метрические параметры рассчитывали на основе их выживаемости в острых (96 ч) опытах методом пробит-анализа по В.Б. Прозоровскому [20]. Суммарная величина выборки по каждой концентрации и контролю 20 экз. Биохимические исследования проводили на карпах, подвергнутых действию фунгицидов в минимально летальных концентрациях (ЛК16 за 96 ч). В опытах с Трифлоксистроби-ном и Пираклостробином пробы отбирали на 1, 2 и 4-е сутки, а с Димоксистробином еще на 7 и 15-е сутки. Количество опытных рыб на "точку" в биохимических исследованиях 10—15, контрольных — 25—40 особей. У рыб извлекали печень и для анализа использовали 5%-ные гомогенаты, приготовленные на охлажденном физиологическом растворе (0.15 М №С1) с 0.1%-ным тритоном Х-100 в гомогенизаторе Поттера-Эльвегейма. Через 10 мин после приготовления гомогенаты центрифугировали 15 мин при 3 тыс. об/мин. В супернатантах определяли содержание вторичного молекулярного продукта ПОЛ — малонового диальдегида (МДА) [22]; активность ферментов антиоксидант-ной защиты — супероксиддисмутазы (СОД, КФ 1.15.1.1) — модифицированным методом Мис-ра, Фридович [32] и каталазы (КТ КФ 1.11.1.6) [10]; активность ферментов первой фазы детокси-кации — ацетилэстеразы (АцЭ, КФ 3.1.1.6) — методом Покровского в собственной модификации [19] и карбоксилэстеразы (КарбЭ, КФ 3.1.1.1) [1]. Состояние глутатионовой системы регистрирова-
ли по содержанию восстановленного глутатиона (Г8Н) [27] и активности ферментов глутатион-8-трансферазы (Г8Т, КФ 2.5.1.18) [28], глутатионре-дуктазы (ГР, КФ 1.6.4.2) [25] и у-глутамилтрансфе-разы (ГГТ, КФ 2.3.2.2) [9]. Количество общего белка определяли по методу Лоури [29]. Результаты представлены в виде средних и их ошибок (М ± т). Достоверность различий между двумя выборками оценивали при р = 0.05, используя ¿-критерий Стьюдента и критерий Шовене для резко отклоняющихся вариант [8].
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Все исследованные стробилурины оказывали острое летальное действие на сеголетков карпа в концентрациях 0.039—0.09 мг/л (ЛК50 за 96 ч). Рассчитанные токсикометрические параметры представлены в табл. 1. Клиническая картина первичного отравления карпа при действии стробилури-нов характеризовалась признаками нервно -паралитического характера и проявлялась в дозо-зависимом изменении поведенческих реакций рыб. С увеличением концентраций происходило нарушение рефлекса равновесия, дискоординация движений, учащение дыхательного ритма. Особи совершали резкие спиралевидные движения к поверхности воды, заглатывали воздух. Эти симптомы возникали уже через 1—2 ч после внесения стробилуринов в воду. Стадия возбуждения сменялась состоянием общего угнетения с полной потерей равновесия: рыбы занимали боковое положение или плавали хвостом вверх у поверхности воды, дыхание становилось медленным и неритмичным, полностью отсутствовала реакция на внешние раздражители. У отдельных особей отмечены резкие короткие перемещения, судороги. Рыбы погибали у поверхности воды, не опускаясь на дно аквариума. При внешнем осмотре погибших рыб, подвергшихся действию Димоксистро-бина в течение 15 сут, отмечали признаки асфиксии (приподнятые жаберные крышки и открытое ротовое отверстие), тело сильно изогнуто. При вскрытии брюшной полости отмечено, что печень опытных рыб отличалась мягкой водянистой консистенцией и светлой желтоватой окраской, желчный пузырь имел темно-изумрудный оттенок и
Таблица 2. Изменения содержания малонового диальдегида, активности антиоксидантных ферментов и эстераз в печени карпа под действием Пираклостробина и Трифлоксистробина в концентрациях ЛК16 при экспозиции 96 ч
Пестицид Контроль Экспозиция, ч
24 48 96
Содержание малонового диальдегида, мкмоль/мг белка
Пираклостробин 57.96 ± 3.90 69.97 ± 6.97* 73.96 ± 3.32*
Трифлоксистробин 59.32 ± 2.10 54.95 ± 5.07 71.46 ± 2.68* 75.23 ± 5.72*
Активность супероксиддисмутазы, усл. ед./(мг белка • мин)
Пираклостробин 0.48 ± 0.02 0.40 ± 0.02* 0.53 ± 0.04
Трифлоксистробин 0.53 0.02 0.58 ± 0.04 0.45 ± 0.02* 0.38 ± 0.01*
Активность каталазы, мкмоль/(мг белка • мин)
Пираклостробин 14.89 ± 0.74 17.23 ± 1.00* 19.96 ± 0.63*
Трифлоксистробин 14.43 ± 0.46 15.40 ± 0.92 18.94 ± 0.93* 19.47 ± 1.23*
Активность ацетилэстеразы, нмоль/(мг белка • мин)
Пираклостробин 54.86 ± 4.33 54.84 ± 7.47 69.21 ± 11.03*
Трифлоксистробин 51.88 ± 3.57 71.74 ± 7.38* 98.96 ± 9.83* 130.48 ± 9.55*
Активность карбоксилэстеразы, нмоль/(мг белка мин)
Пираклостробин 404.48 ± 18.46 531.07 ± 44.82* 609.23 ± 61.85*
Трифлоксистробин 421.56 ± 25.68 688.68 ± 50.8* 704.00 ± 43.62* 674.26 ± 65.28*
Примечание. Здесь и в табл. 3: концентрация Пираклостробина и Трифлоксистробина — 0.024 и 0.073 мг/л соответственно; "*" — различия по сравнению с контролем достоверны (р < 0.05).
был увеличен в 2—3 раза, наблюдалась гиперемия в жабрах и внутренних органах.
При действии Пираклостробина и Трифлоксистробина в минимальных летальных концентрациях (ЛК16 за 96 ч) отмечено увеличение содержания МДА в печени на вторые и четвертые сутки на 18— 27% контрольных значений. В те же сутки достоверно снижалась активность СОД, а активность КТ постоянно возрастала и к концу эксперимента достигала максимальных отличий от контроля на 35—38% (табл. 2). Одновре
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.