ГЕНЕТИКА, 2015, том 51, № 3, с. 362-370
ГЕНЕТИКА ЖИВОТНЫХ =
УДК 577.29
ДЛИНА И СТРУКТУРА ТЕЛОМЕРНОЙ ДНК У ТРЕХ ВИДОВ БАЙКАЛЬСКИХ БРЮХОНОГИХ МОЛЛЮСКОВ (Caenogastropoda: Hydrobioidea: Benedictiidae)
© 2015 г. А. Г. Королева1, Е. В. Евтушенко2, Н. В. Максимова1, А. В. Вершинин2, Т. Я. Ситникова1, С. В. Кирильчик1
1Лимнологический институт Сибирского отделения Российской академии наук, Иркутск 664033
e-mail: takonedo.bb@mail.ru 2Институт молекулярной и клеточной биологии Сибирского отделения Российской академии наук, Новосибирск 630090 Поступила в редакцию 07.07.2014 г.
Определена структура теломерного повтора (TTAGGG)n и измерена длина теломерной ДНК (тДНК) у трех видов брюхоногих моллюсков семейства Benedictiidae — эндемиков оз. Байкал. Выявленная структура теломерного повтора подтверждена его локализацией на концах хромосом методом флуоресцентной in situ гибридизации (FISH). Размеры тДНК у "гигантского" эврибатного, псам-мо-пелобионтного вида Benedictia fragilis и мелководного лито-псаммобионтного вида B. baicalensis co средними размерами раковины оказались сходными (соответственно 16 ± 2.9 и 15 ± 2.1 тпн), но имели большую длину, чем у мелководного спонгио-литобионтного вида с маленькой раковиной Kobelto-cochlea martensiana (10.5 ± 1.5 тпн). Обсуждаются тенденции возрастного изменения длины тДНК улиток и возможный механизм поддержания размеров теломер в онтогенезе.
DOI: 10.7868/S0016675815030066
Теломеры являются специализированными районами на концах хромосом. Они выполняют важнейшие функции поддержания стабильности размеров хромосом и защиты их от хромосомных перестроек, делеций, действия нуклеаз и других неблагоприятных факторов. У большинства видов животных ДНК этих районов представлена тяжами коротких (5—6 пн) повторов, простирающихся вглубь хромосомы у некоторых видов до нескольких десятков тысяч пар нуклеотидов. Наиболее распространенным типом повтора является ТТЛООО [1]. Длина тДНК является вариабельной величиной и отличается не только у разных видов, но и на разных концах одной хромосомы [2, 3]. Существуют предположения о связи длины тДНК с размерами тела и продолжительностью жизни (ПЖ) [4—6]. На примере отряда грызунов (ЯоёепИа) было показано, что у более крупных представителей длина тДНК была меньше вследствие присутствия репликативного старения как механизма защиты от рака [6, 7]. Также было выявлено, что у некоторых птиц более длинная тДНК способствует их выживаемости [8]. Однако до настоящего момента не выявлено определенной тенденции в динамике значительного разнообразия размеров теломер и стабильной корреляции этого признака с характеристиками размера тела и ПЖ.
Моллюски — это крупный по количеству видов (около 100000) тип беспозвоночных животных.
Среди разнообразия форм и размеров известны виды гиганты и долгожители. Например, гигантские кальмары Architeuthis sanctipauli за 14 лет вырастают до 2.4 м [9], а известный максимальный размер тела кальмара составляет 16.5 м [10]. Морские двустворчатые моллюски Tridacna gigas при длине раковины 106 см живут 63 года [11], а представители Arctica islandica с небольшой раковиной размером 13 см являются долгожителями, достигающими возраста 500 лет [12, 13].
Указанные особенности делают моллюсков интересными объектами с точки зрения анализа влияния различных возрастных, экологических и эволюционных факторов на размеры и структуру теломерных участков хромосом. На сегодняшний день сравнительному изучению изменений тДНК моллюсков с возрастом и в зависимости от условий среды обитания посвящено немного работ [14—16]. Длина тДНК определена всего у нескольких видов моллюсков [14—18], хотя цитоге-нетические исследования локализации теломер-ных повторов на хромосомах более многочисленны [17-27].
Удобными объектами для изучения перечисленных выше проблем являются гастроподы самого глубокого озера в мире Байкал, которое, как и все древние озера, считается природной лабораторией по исследованию процессов эволюции [28, 29]. В настоящее время известно 150 видов
байкальских брюхоногих моллюсков, из них 78% являются эндемиками озера, населяющими различные биотопы до глубины 1300 м, в том числе метановые и нефтяные сипы [30]. Объектами для настоящего исследования послужили три вида эндемичных гастропод семейства ВепеёкШёае: B.fragilis, В. Ъа1са1еп$15 и К. таг1гт1апа, которые различаются размерами раковины и биотопической локализацией [31]. Улитки вида В. fragilis относятся к байкальским "гигантам" и являются эврибионтами, живущими на глубинах от 30—50 до 1300 м и предпочитающие мягкие (песчано-илистые) грунты. Гастроподы видов В. Ъaicalensis и К. martensiana — мелководные, редко уходящие глубже 50 м, первый из них среднего размера обитает на смешанных грунтах, второй — с самой мелкой раковиной, предпочитает каменистый субстрат с обрастаниями губок. Все исследованные улитки — яйцекладущие, образуют скопления в период массового размножения; по типу питания являются "пасущимися на субстрате" или соскребателями. Оба вида рода Вепе^сйа — всеядные, тогда как улитки рода КоЪеиососМеа являются детрито-растительноядными [31].
Целью настоящей работы было определение структуры и размеров тДНК у трех близкородственных видов гастропод, различающихся размерами раковины и экологическими характеристиками, а также выявление локализации теломерных повторов на хромосомах улиток. Полученные нами данные свидетельствуют о том, что тДНК у байкальских моллюсков представлена каноническим ТТЛООО повтором, локализованным на концах хромосом. Кроме того, было показано, что длина теломер у видов с крупным и средним размером раковины достоверно больше, чем у вида с малым размером раковины.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Особи вида В. fragilis собраны тралом в Чивыр-куйском заливе (июль 2010 г.) с глубин 40—60 и 110—200 м, особи вида В. Ъaicalensis собраны аквалангистами в заливе Лиственичный (февраль 2010 г., март 2011 г.) с 13—15 м и особи вида К. таг-tensiana — водолазным сбором в пади Варначка (март 2011 г.) с 10—40 м. Исследованы шесть особей вида В. fragilis, пять — В. Ъaicalensis и шесть — K. martensiana. Возраст гастропод определен по количеству линий ежегодной приостановки роста на раковине [32—34]. Размеры и возраст проанализированных видов улиток представлены в таблице.
Для определения структуры теломерных повторов в геномной ДНК исследованных видов проводили полимеразную цепную реакцию (ПЦР) с одним праймером, комплементарным теломерной ДНК [35], что дает результат, аналогичный прямому секвенированию. Были исполь-
Размерно-возрастные характеристики исследованных видов
Вид Высота раковины, мм Ширина раковины, мм Возраст, годы
B. fragilis 16.8 11.9 0.5
16.2 12.3 1
24.1 19.7 3
24.4 18.7 3
47.5 37.3 8
48.5 38.2 8
B. baicalensis 6.8 6.0 2
7.6 6.4 2
9.8 8.4 3
18.7 16.0 6
19.2 19.0 8
K. martensiana 5.0 4.5 3
5.3 4.8 3
7.0 6.2 5
7.1 6.1 5
9.1 8.1 7
10.5 9.3 8
зованы два типа праймеров: на канонический те-ломерный повтор TTAGGG (праймер B, от "base", 5'-TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGG-GTTAGGG-3') и на теломерный повтор TTAGG, свойственный членистоногим (праймер A, от "Ar-thropoda", 5'-GGTTAGGTTAGGTTAGGTTAGG-3'). Смесь для ПЦР содержала 1-кратный буфер, 250 нмоль каждого из четырех dNTP, 0.5 пмоль праймера (B или A), 100 нг тотальной ДНК и 0.1— 0.2 ед. акт. Encyclo полимеразы (ЗАО Евроген) в общем объеме 10 мкл. В качестве положительного контроля использовался продукт ПЦР с G- и C-богатыми праймерами без добавления матрицы. Условия реакции были следующие: начальная денатурация ДНК (94°С — 1.5 мин), далее 35 циклов синтеза фрагмента (94°С — 1 мин, 63°С — 40 с, 72°С — 2.5 мин). Перед окончанием реакционную смесь выдерживали при 72°С 10 мин.
Выделение ДНК из тканей ноги моллюсков осуществляли с использованием стандартного метода экстракции фенол—хлороформом с некоторыми модификациями (как описано в [5]). Анализ терминальных фрагментов рестрикции, рестрикцию и пульс-электрофорез, мечение проб (TTAGGG)n и блот-гибридизацию проводили, как описано в [5].
Препараты метафазных хромосом готовили из семенников B. baicalensis. После диссекции тела
кусочки гонады помещали в 0.56% KCl, измельчали и оставляли при 37°С на 15 мин. Затем фиксировали смесью метанола и уксусной кислоты (3 : 1), выдерживали при 5°С 15 мин, центрифугировали, убирали надосадочную жидкость и снова повторяли процедуру 3 раза. На охлажденные предметные стекла (до —20°С) капали суспензию клеток над водяными парами (70—80°С) и высушивали в течение 10 мин. Потом выдерживали препараты при комнатной температуре несколько суток. Те-ломерную пробу получали безматричной ПЦР [36] и метили ее Bio-11-dUTP посредством классической ПЦР с праймерами на теломерные районы. Флуоресцентную гибридизацию in situ (FISH) тело-мерной пробы на препаратах проводили в соответствии с протоколом [37] с некоторыми изменениями. После отмывки в 1х PBS, содержащим 50 мМ Mg2+, препараты обрабатывали 0.12%-ным трипсином в течение 20 с. Далее препараты фиксировали в 0.5%-ном формальдегиде и 1х PB S (10 мин), промывали в PBS и дегидрировали в этаноле. Гибридизационная смесь (20 мкл) содержала 50%-ный формамид, 2х SSC и теломерный зонд. Перед гибридизацией смесь денатурировали в течение 5 мин при 96°С, охлаждали во льду и наносили на препарат. Гибридизация шла в течение ночи при 42°С. Детекция биотинилирован-ного зонда проводилась с помощью флуоресцентно меченого стрептавидина (Streptavidin-Cy3, "Sigma"). Препараты окрашивали флуорохромом DAPI (4,6-диамино-2-фенилиндол, 0.5 мкг/мл) в среде Vectashield (Vector laboratories, Великобритания) и анализировали на флуоресцентном микроскопе Olympus BX51. Отобранные метафазные пластинки фотографировали при увеличении 100х (камера DP70, источник света X-Cite 120Q).
Определение длины тДНК (предельных и средних значений) проводили в программе Image Quant TL v. 2005. Статистическую обработку полученных результатов осуществляли непараметрическими методами для небольших выборок в программе STATISTICA-10. Уровень межвидовых различий длины тДНК оценивали с помощью теста Kruskal—Wallis. Для определения вн
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.