БИОХИМИЯ, 2013, том 78, вып. 4, с. 533 - 540
УДК 577.23
ДЛИННОЦЕПОЧЕЧНЫЕ а,ю-ДИОЛОВЫЕ КИСЛОТЫ КАК ИНДУКТОРЫ ЦИКЛОСПОРИН А-НЕЧУВСТВИТЕЛЬНОЙ НЕСПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПРОНИЦАЕМОСТИ ВНУТРЕННЕЙ МЕМБРАНЫ МИТОХОНДРИЙ ПЕЧЕНИ, НАГРУЖЕННЫХ ИОНАМИ КАЛЬЦИЯ ИЛИ СТРОНЦИЯ
© 2013 г. М.В. Дубинин, С.И. Адакеева, В.Н. Самарцев*
Марийский государственный университет, 424001 Йошкар-Ола, пл. Ленина, 1; факс: (836-2)56-5781; электронная почта: samvic56@mail.ru
Поступила в редакцию 23.07.12 После доработки 31.10.12
В митохондриях печени, нагруженных Са2+ или 8г2+, предельные длинноцепочечные монокарбоновые жирные кислоты способны индуцировать неспецифическую проницаемость внутренней мембраны (открытие поры) по нечувствительному к циклоспорину А механизму. В настоящей работе исследовано действие их метаболитов — а,ю-диоловых (дикарбоновых) кислот как потенциальных индукторов открытия поры по аналогичному механизму. Установлено, что внесение к митохондриям печени, нагруженных Са2+ или 8г2+, а,ю-гексадекандиоловой кислоты (ГДК) в концентрации 10—30 мкМ проводит к набуханию органелл и выходу этих ионов из матрикса. Максимальный эффект ГДК наблюдается при концентрации Са2+ 50 мкМ, причем прединкубация митохондрий с циклоспорином А не устраняла эффект ГДК. Ингибитор кальциевого унипортера рутениевый красный, блокирующий вход Са2+ и 8г2+ в матрикс, предотвращал индуцированное ГДК набухание митохондрий. Действия ГДК как индуктора набухания митохондрий были сравнены с аналогичными эффектами а,ю-тетрадекандиоловой и а,ю-додекандиоловой кислот, имеющих в ацильной цепи соответственно на 2 и 4 атома углерода меньше, чем у ГДК. Установлено, что эффективность этих а,ю-диоловых кислот снижается по мере уменьшения числа атомов углерода в их ацильной цепи. Сделан вывод о том, что предельные длинноцепочечные а,ю-диоловые кислоты в присутствии Са2+ или 8г2+ способны индуцировать циклоспорин А-нечувствительную неспецифическую проницаемость внутренней мембраны (открытие поры) митохондрий печени также эффективно, как и их монокарбоновые аналоги.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: митохондрии печени, а,ю-диоловые кислоты, циклоспорин А-нечувствительная пора, ионы кальция.
а,ю-Диоловые (а,ю-дикарбоновые) кислоты образуются в клетках печени путем ю-окисле-ния соответствующих монокарбоновых жирных кислот [1—4]. В нормальных физиологических условиях ю-окисление жирных кислот составляет около 5—10% от их суммарного метаболизма в клетках печени. Однако ю-окисление значительно усиливается при некоторых состояниях, сопровождающихся увеличением содержания свободных монокарбоновых жирных кислот (ожирение, голодание, диабет и др.), а также при различных нарушениях их метаболизма (главным образом, р-окисления) [3, 4]. Показано, что ю-окисление жирных кислот в клетках печени также значительно усиливается под вли-
Принятые сокращения: ГДК — а,ю-гексадекандио-ловая кислота, ПЭГ — полиэтиленгликоль.
* Адресат для корреспонденции.
янием некоторых ксенобиотиков и при хроническом действии этанола [5, 6]. До сих пор не ясно, в какой степени повышение уровня а,ю-диоловых кислот в клетках печени связано с нарушением функций этого жизненно важного органа при различных патологических состояниях. Существует предположение, что активация ю-окисления различных монокарбоновых жирных кислот при ингибировании других путей их метаболизма способствует даже выживаемости клеток печени [2, 4].
В настоящее время рассматривается несколько типов гибели клеток, отличающихся как по морфологическим признакам, так и по биохимическим механизмам. Однако во всех случаях центральную роль в этих процессах отводят митохондриям, интегрирующим множество внутриклеточных сигнальных путей, ведущих к гибели клетки [7—9]. Одним из связанных с ми-
тохондриями звеньев в сложном механизме гибели клеток является индукция кальций-зависимой неспецифической проницаемости внутренней мембраны (открытие поры). Это, в свою очередь, приводит к нарушению энергетических функций митохондрий, прежде всего синтеза АТР, а также к выходу из межмембранного пространства в цитоплазму так называемых апоптоген-ных белков: цитохрома с, индуцирующего апоп-тоз фактора, эндонуклеазы О и др. [8, 9].
Достаточно хорошо известно, что одними из эффективных природных индукторов неспецифической проницаемости внутренней мембраны митохондрий печени являются свободные монокарбоновые жирные кислоты [10—15]. Последние могут индуцировать «классическую» пору через взаимодействие с ADP/ATP антипортером (другое название адениннуклеотид-транслоказа), который является модулятором митохондриальной поры. В этом случае воздействие жирных кислот на митохондрии проявляется только в присутствии Са2+ (другие двухвалентные катионы не эффективны) и подавляется циклоспорином А [12]. Вместе с тем установлено, что пальмитиновая и некоторые другие предельные жирные кислоты в митохондриях печени способны индуцировать открытие «неклассической» неспецифической поры, нечувствительной к циклоспорину А. Для развития этого эффекта ионы Са2+ могли бы быть заменены ионами других двухвалентных катионов, при этом ненасыщенные жирные кислоты были не способны индуцировать открытие такой поры [12—16]. Показано, что такая пора способна самопроизвольно закрываться [12, 14]. Было предположено, что индуцированная пальмитиновой кислотой и другими предельными жирными кислотами циклоспорин А-нечувствительная пора во внутренней мембране митохондрий имеет липидную природу. В соответствии с этой гипотезой формирование такой поры связано с образованием в липидной фазе мембраны комплексов Са2+ (8г2+) с жирной кислотой в виде отдельных мембранных доменов с последующим разрывом монослоя [14—16].
Данные о влиянии длинноцепочечных а,ю-диоловых кислот на энергетические функции изолированных митохондрий фрагментарны и противоречивы. Так было установлено, что в отсутствие ионов Са2+ а,ю-тетрадекандиоловая кислота стимулирует дыхание митохондрий печени без снижения мембранного потенциала [17]. В этом случае ее воздействие похоже на так называемые десопрягающие агенты [18, 19]. Напротив, действие на митохондрии печени не-метаболизирующегося аналога длинноцепочеч-ных а,ю-диоловых кислот MEDICA16 приводит
как к стимуляции дыхания, так и к снижению мембранного потенциала [20]. В присутствии ионов кальция способность MEDICAl6 снижать мембранный потенциал устраняется циклоспорином А, что рассматривается авторами как свидетельство способности MEDICA16 индуцировать неспецифическую проницаемость внутренней мембраны митохондрий [21]. Разумно предположить, что природные а,ю-дио-ловые кислоты так же эффективно, как и предельные монокарбоновые жирные кислоты, способны индуцировать неспецифическую проницаемость внутренней мембраны митохондрий. В этом случае накопление а,ю-диоловых кислот в клетках печени можно было бы рассматривать как один из факторов, располагающих к их гибели.
В настоящей работе с целью выяснения роли а,ю-диоловых кислот как индукторов циклоспорин А-нечувствительной неспецифической проницаемости внутренней мембраны (открытие поры) митохондрий печени изучено влияние а,ю-гексадекандиоловой кислоты (ГДК) на процесс набухания этих органелл, нагруженных Са2+ или 8г2+. Было также исследовано действие ГДК на транспорт Са2+ или 8г2+ через внутреннюю мембрану митохондрий как в отсутствие, так и в присутствии ингибитора кальциевого унипортера рутениевого красного. Особое внимание было уделено созданию условий, препятствующих открытию классической Са2+-зависи-мой поры. Для этого в большинстве опытов митохондрии были инкубированы с циклоспорином А, который полностью подавляет открытие поры Са2+ и неорганическим фосфатом. Исследуемые эффекты ГДК сравнены с действием а,ю-диоловых кислот с более короткой ациль-ной цепью. Полученные данные рассматриваются как свидетельство того, что а,ю-диоловые кислоты в митохондриях печени, нагруженных Са2+ или 8г2+, индуцируют открытие циклоспорин А-нечувствительной поры.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Митохондрии из печени белых половозрелых крыс-самцов массой 210—250 г выделяли общепринятым методом дифференциального центрифугирования с последующим освобождением от эндогенных жирных кислот с помощью БСА в соответствии с описанной ранее методикой [17]. Среда выделения содержала 250 мМ сахарозы, 1 мМ EGTA, 5 мМ Hepes, рН до 7,4 (доводили Tris). Концентрацию белка митохондрий определяли с помощью биуретового метода, в качестве стандарта использовали раствор БСА.
Во время проведения эксперимента суспензию митохондрий (60—70 мг митохондриального белка в 1 мл) хранили на льду в узкой пробирке типа «Eppendorf».
Исследование проницаемости внутренней мембраны митохондрий для Ca2+ и Sr2+ проводили с помощью ионоселективного электрода ЭЛИС-121Са («Измерительная техника», Россия) и универсального иономера И-500 («Аквилон», Россия) в ячейке объемом 10 мл и при температуре 25°. Среда инкубации содержала 200 мМ сахарозы, 20 мМ KCl, 20 мкМ EGTA, 5 мМ янтарной кислоты, 10 мМ Hepes, рН до 7,4 (доводили Tris). В ячейку сразу после митохондрий (~0,8 мг/мл) добавляли ротенон (2 мкМ) и (при необходимости) 1 мкМ циклоспорин А. Все другие добавки осуществляли как указано на рисунках. Набухание митохондрий регистрировали по изменению оптической плотности суспензии митохондрий (А) при длине волны 540 нм на спектрометре «КФК-3-01» («ЗОМЗ», Россия) в кювете объемом 4 мл и при температуре 25°. Скорость набухания митохондрий определяли как изменение оптической плотности суспензии митохондрий в течение первой минуты набухания. Состав среды инкубации и условия проведения экспериментов аналогичны описанному выше. При проведении экспериментов в контрольных пробах к митохондриям добавляли растворители в том же объеме как и в опытах с исследуемыми веществами. Во всех случаях растворители не изменяли исследуемые параметры митохондрий.
В работе использовали а,ю-гексадекандио-ловую кислоту (ГДК), а,ю-тетрадекандиоловую кислоту, а,ю-додекандиоловую кислоту, рутениевый красный, янтарную кислоту, циклоспорин А, очищенный от жирных кислот БСА, Hepes, Tris («Sigma», США); ротенон, EGTA («Serva», Германия); полиэтиленгликоль (ПЭГ) с
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.