научная статья по теме ДНК-CВЯЗЫВАЮЩАЯ АКТИВНОCТЬ БИC-НЕТPОПCИНОВ, CОДЕPЖАЩИX ЦИC-ДИАМИНОПЛАТИНОВУЮ ГPУППУ МЕЖДУ ДВУМЯ НЕТPОПCИНОВЫМИ ФPАГМЕНТАМИ Биология

Текст научной статьи на тему «ДНК-CВЯЗЫВАЮЩАЯ АКТИВНОCТЬ БИC-НЕТPОПCИНОВ, CОДЕPЖАЩИX ЦИC-ДИАМИНОПЛАТИНОВУЮ ГPУППУ МЕЖДУ ДВУМЯ НЕТPОПCИНОВЫМИ ФPАГМЕНТАМИ»

БИОФИЗИКА, 2008, том 53, вып.5, c.744-753

МОЛЕКУЛЯР НАЯ БИОФИЗИКА =

УДК 577.3

ДНК-СВЯЗЫВАЮЩАЯ АКТИВНО СТЬ БИ C-НЕТР ОПСИНОВ, СОДЕРЖАЩИX ^ис-ДИАМИНОПЛАТИНОВУЮ ГРУППУ МЕЖДУ ДВУМЯ НЕТРОПСИНОВЫМИ ФРАГМЕНТАМИ

© 2008 г. А.Н. Суровая, С.Л. Гроховский, Н.П. Бажулина, Г.В. Гурский

Институт молекулярной биологии им. В .А. Энгельгардта РАН, 119991, Москва, ул. Вавилова, 32

E-mail: annasur@eimb.ru Поступила в p едакцию 24.03.08 г.

Исследовано связывание с ДНК Pt-bis-Nt и его модифицированного аналога (Pt*-bis-Nt), который отличается от Pt-bis-Nt тем, что в нем соединительная цепь между двумя нетроп-синовыми фрагментами содержит два дополнительных остатка глицина. Увеличение длины соединительной цепи в молекуле бис-нетропсина привело к увеличению цитотоксичности и практически к полному исчезновению антигерпетической активности бис-нетропсина. Исследование связывания двух бис-нетропсинов с олигонуклеотидным дуплексом, содержащим АТ-кластер, присутствующий в участке начала репликации ДНК вируса герпеса (OriS), позволило обнаружить существенные различия в структур е комплексов бис-нетр опсинов с этим олигомером ДНК. C помощью КД-спектроскопии показано, что связывание Pt-bis-Nt в р астянутой конформации и в фор ме шпильки с параллельной ориентацией двух нетр опсиновых фрагментов вносит значительно больший вклад, чем это имеет место при образовании комплекса с Pt*-bis-Nt. П р и высоких ур овнях связывания Pt*-bis-Nt связывается с АТ-кластером в OriS преимущественно в форме ассоциатов, построенных на основе антипаралельного двутяжевого пирролкарбоксамидного мотива. Исследовано также взаимодействие Pt-bis-Nt и Pt*-bis-Nt с однотяжевым олигонуклеотидом (64 нуклеотида), соответствующим верхней нити в начале репликации вируса герпеса (OriS*). C помощью КД-спектроскопии и исследования плавления комплексов бис-нетр опсинов с OriS* обнаружено значительное различие в связывании бис-нетропсинов с OriS* и термостабильности обр азующихся комплексов.

Ключевые слова: бис-нетропсины, специфическое узнавание в малом желобе ДНК, круговой дихроизм, кривые плавления, антигерпетическая активность.

Конструирование и синтез специфичных ДНК-связывающих соединений, способных избирательно связываться с функционально важными участками вир усной ДНК и эффективно подавлять р епродукцию вир уса, представляет несомненный интерес. Наиболее интересные результаты были получены при использовании в качестве строительных блоков для синтеза новых лигандов аналогов противоопухолевых антибиотиков нетропсина и дистамицина. С помощью рентгеноструктурного анализа [1-3] и ЯМР-спектроскопии [4-5] показано, что эти антибиотики связываются в узком желобе ДНК с кластерами из четырех-пяти АТ-пар оснований. Очевидный путь для повышения избирательности связывания этих соединений с ДНК - это синтез димерных (олигомерных) производных нетропсина и дистамицина, в которых два или более мономерных фрагмента были бы

Сокращение: КД - круговой дихроизм.

соединены ковалентно с помощью различных линкеров [6-9].

П р отивовирусная активность бис-нетр опсинов, в которых мономерные фрагменты соединены ковалентно в ориентации хвост-к-хвосту с помощью алифатических линкеров различной длины, исследовалась Де Клерком и Лоуном [10]. Эти авторы обнаружили, что бис-нетропсины эффективно подавляют репродукцию вируса о сповакцины в культуре клеток, в то время как их противогерпетическая активность наблюдалась на ур овне субтоксических концентр аций.

В наших предыдущих р аботах была синтезирована и исследована новая серия бис-не-тр опсинов с р азличными линкерами и различной ориентацией нетропсиновых фрагментов [11-13]. Показано, что некоторые из этих соединений обладали существенно более высокой противогерпетической активностью и меньшей цитотоксичностью, чем наблюдалось у антибиотиков - нетр опсина и дистамицина или со-

Рис. 1. Xимичеcкие фоpмулы нетpопcина (Nt) и биc-нетpопcинов, Pt-bis-Nt и Pt*-bis-Nt, cодеpжащиx в линкеpе цис-диаминоплатиновую гpуппу.

единений, иccледованныx Де Клеpком и Лоуном [10-13].

Pанее мы обнаpужили, что небольшие изменения в cтpуктуpе биc-нетpопcина могут оказать значительное влияние на pавновеcие между pазличными типами комплекcа, обpазуемого биc-нетp огоином c ДНК. Биc-нетpопcины могут cвязыватьcя c клаcтеp ами АТ-паp в pаcтянутой конфоpмации, занимая пpимеpно один виток cпиpали ДНК, они могут также cвязыватьcя в фоpме шпильки c паpаллельной и антипаpал-лельной укладкой двуx нетpопcиновыx фpаг-ментов в узкой боp оздке ДНК, занимая четьфе-пять паp оcнований. Биc-нетpопcины могут также обpазовывать димеpный тип комплекcа за cчет cлипания «половинок» двуx молекул бж-нетpопcина, cвязанныx на cоcедниx пеpекpы-вающиxcя cвязывающиx меcтаx. Вcе эти ком-плекcы можно легко диcкpплинтовать c помощью КД-cпектpоcкопии [14-16]. Обнаpужено также влияние локальной cтpуктуpы ДНК на

cp одcтво и cпецифичноcть cвязывания pазлич-ныx биc-нетpопcинов c ДНК [16].

В нашей ^едыдущей pаботе [17] было показано, что Pt-bis-Nt и его модифициpованный аналог Pt*-bis-Nt cвязываютcя c поли^А^по-ли(dT) пpеимущеcтвенно в pаcтянутой конфоp-мации c помощью двуx нетpопcиновыx фpаг-ментов. C помощью ДНКазного футпpинтинга показано, что ^ и cвязывании c AT-клаcтеpом в начале pепликации виpуcа геpпеcа (01^) Р^ bis-Nt защищает более ^отяженную облаcть и обладает большим cpодcтвом к АТ-клаcтеpу, чем Pt*-bis-Nt [17].

В наcтоящей pаботе c помощью КД-отек-тpоотопии и дpугиx физико-xимичеcкиx методов мы обнаpужили cущеcтвенные pазличия в cтp уктуpе комплекcов, обpазующиxcя пpи взаи-модейcтвии биc-нетpогоинов c дуплекcом, то-деpжащем АТ-класт^ (18 AT-паp оcнований), пp ^уто^ующий в учаcтке начала pепликации

(а)

5

,AAAAGAAGTGÄGAÄCGCGAAGCGTTCGCACTTCGTCCCÄATATATATATATTATTAGGGCGAAGTGCGAGCACTGGCGCC ,

Box III

Box I

A + T

Box II

TTTTCTTCACTCTTGCGCTTCGCAAGCGTGAAGCAGGGTTATATATATATAATAATCCCGCTTCACGCTCGTGACCGCGG

Рис. 2. Нуклеотидная последовательность в участке начала репликации OriS вируса герпеса простого первого типа (а). Указаны связывающие места для инициаторного белка UL9 (Boxes I-III). Отмечены также палиндромные последовательности и показана вторичная структура, которую спонтанно принимает верхняя нить после расплетения дуплекса (б).

ДНК вируса герпеса (Оп8). Мы также исследовали взаимодействие Р1;-Ы8-Ш и Р1;*-Ы8-№ с однотяжевым олигонуклеотидом (64 нуклеоти-да), соответствующим верхней нити в участке начала репликации ДНК (Оп8*) и обнаружили существенные р азличия в ДНК-связывающей активности двух бис-нетропсинов, а также различие в термостабильности комплексов, обр а-зуемых бис-нетропсинами со шпильками в Оп8*.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Лиганды. На рис. 1 представлены химические стр уктуры нетр опсина, и двух бис-нетропсинов, Р1;-Ы8-Ш и Р1;*-Ы8-Ш, содержащих цис-диаминоплатиновую группу в соединительной цепи между двумя нетропсиновыми фр агмента-ми. Отличие каждого ди-К-пропилпирролкар-боксамидного фрагмента молекулы бис-нетроп-сина от нетропсина состоит в замене С-конце-вой амидиновой группы на остаток третичного амина, замене присутствующего в нетропсине остатка гуанидилуксусной кислоты на остатки глицина, а также в замене К-метилпиррольных циклов на К-пропилпиррольные. Эти замены увеличивают устойчивость соединений к дегр а-

дации в водных р астворах и, возможно, также увеличивают их способность проникать через мембрану клетки. Pt-bis-Nt и Pt*-bis-Nt были синтезированы в соответствии с процедурой, описанной в работе [18]. Концентрации бис-не-тр опсинов опр еделяли спектрофотометр ически, используя коэффициент моляр ной экстинкции в 297 нм, равный 42000 М-1-см-1

Олигонуклеотидный дуплекс. Олигонуклео-тиды с последовательностями сса ata tat ata tat tat tag gc (рис. 2а) и g^ taa taa tat ata tat att gg (рис. 2б) были синтезированы с использованием автоматического синтезатора (АррНе<1 Biosystems) на основе фосфор амидитной химии. Молярную концентрацию олигонуклеотидов определяли спектрофотометр ически с помощью измерения оптической плотности при 260 нм и температуре 90°C. Использовали коэффициент молярной экстинкции при 260 нм, равный 267200 М-1-см-1 и 271600 М-1-см-1для олигонук-леотидов (a) и (б) соответственно. Для образования дуплекса, содержащего олигонуклеоти-ды (а) и (б), комплементарные нити смешивали в эквимолярных концентрациях, смеси отжигали при 90°C, а затем медленно охлаждали до комнатной температуры в течение 8 - 10 ч.

Pиc. 3. Дифференциальные спектры КД, полученные для комплексов Р1;-Ы8-Ш (а) и Р1;*-Ы8-Ш (б) с 23-мерным дуплексом (3 мкМ). АО и АО0 - амплитуды КД, рассчитанные на 1 см оптического пути в присутствии и в отсутствие бис-нетропсина. О - молярная концентрация дуплекса. На (а) - С/О: 1 - 0,25; 2 - 0,50; 3 - 0,74; 4 - 0,99; 5 - 1,32; 6 - 2,07; 7 - 2,50; 8 - 3,31. На (б) - С/О: 1 - 0,47; 2 - 0,95; 3 - 1,26; 4 - 2,00; 5 - 3,15; 6 - 6,30.

К ривые плавления, полученные для дуплексов, имели только один пер еход из двуспирального в расплавленное состояние.

Более пр отяженный однотяжевый олигомер (64 нуклеотида), содержащий АТ-кластер и связывающие места для инициатор ного белка UL9 вируса герпеса, соответствовал верхней нити в участке начала репликации вируса герпеса (OriS*) (рис. 2). Перед экспериментом олиго-нуклеотид отжигался в 0,01 M какодилатном буфере (рН 7,0) в присутствии 0,1 M LiCl. После отжига при 97°C в течение 5 мин ра створ сразу же помещали в лед, чтобы увеличить вероятность образования шпилечной конфор-мации в олигонуклеотиде.

Спектры кругового дихроизма (КД) измеряли на приборе Jasra-720, используя кюветы с длиной оптического пути 1,0; 0,1 и 0,2 см. Спектры поглощения измеряли на спектрофотометре Jasra V-550. И сследования проводили

в 0,01М Na-какодилатном буфере в присутствии 0,1 М NaCl, pH 7,0.

Бис-нетропсины Pt-bis-Nt и Pt*-bis-Nt раствор яли в небольшом количестве этанола, а затем пер еводили в упомянутый выше буфер.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Cвязывание Pt-bis-Nt и Pt*-bis-Nt c 23-мерным дуплексом, cодеpжащем АТ-клаcтеp в участке начала pепликации вирусной ДНК (OriS).

Мы сравнили ДНК-связывающую активность двух бис-нетропсинов на 23-мерном дуплек

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком