ВЕСТНИК РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК, 2013, том 83, № 2, с. 112-119
ОБОЗРЕНИЕ
Б01: 10.7868/80869587313010180
Считается, что у человека процесс полного обновления клеток в организме происходит за 8—10 лет. За сохранение их идентичности отвечают ДНК клеток. Но что происходит, когда молекулы ДНК повреждаются? Исследования ДНК-гликозилаз помогают не только установить механизмы восстановления, но и понять причину некоторых заболеваний, уточнить способы регуляции активности генов и создать новые инструменты для лабораторного анализа. Публикуемая ниже статья написана на основе научного сообщения, сделанного автором на заседании Президиума СО РАН.
ДНК-ГЛИКОЗИЛАЗЫ - ОСНОВНЫЕ ЭЛЕМЕНТЫ СИСТЕМЫ РЕПАРАЦИИ ДНК
Д.О. Жарков
Ежедневно 100 тыс. звеньев молекул ДНК каждой клетки человеческого тела повреждаются за счёт разнообразных эндогенных процессов и экзогенных генотоксичных воздействий. Изменение и нарушение ДНК могут приводить к появлению мутаций, провоцировать гибель клетки или служить толчком к её злокачественному перерождению. Для предотвращения таких последствий в клетке существует несколько взаимодополняющих ферментативных систем, которые поддерживают процессы, носящие общее название "репарация ДНК" [1, 2]. Главная цель всех этих систем — восстановление последовательности ДНК, существовавшей до повреждения, или, если это невозможно, сведение изменений к минимуму.
Системы репарации отличаются друг от друга используемыми субстратами, ферментами и механизмами устранения повреждённых звеньев. На данный момент выделяют шесть главных систем репарации [1, 2]. В ходе нескольких не связанных друг с другом процессов, объединяемых под общим названием "реактивация", повреждённые основания ДНК непосредственно превращаются в нормальные без расщепления ДНК
ЖАРКОВ Дмитрий Олегович — доктор биологических наук, заведующий группой взаимодействий биополимеров Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН.
и её последующего синтеза. Например, образующиеся под действием ультрафиолетового излучения циклобутановые пиримидиновые димеры при облучении клетки светом видимого спектра превращаются в два исходных пиримидиновых основания прокариотическим ферментом фото-лиазой. Все остальные системы репарации действуют с деградацией и повторным синтезом нарушенной части ДНК. В случае сильного изменения ДНК — образования двуцепочечных разрывов, обширных однонитевых брешей, сшивок между цепочками — функционирует система рекомбина-ционной репарации, при которой повреждённая ДНК исправляется за счёт рекомбинации с полноценной копией генетического материала, если та присутствует в клетке. Двуцепочечные разрывы также могут лигироваться в процессе воссоединения негомологичных концов, что, однако, ведёт к потере части генетического материала. Неканонические пары оснований и короткие ге-теродуплексы в ДНК идентифицируются системой мисматч-репарации, которая удаляет включающий неканонический элемент фрагмент ДНК длиной до нескольких сотен дезоксирибонуклео-тидов и застраивает образовавшуюся брешь. Для эксцизионной репарации нуклеотидов, субстратами которой являются объёмные аддукты в ДНК, также характерно вырезание участка ДНК с последующим синтезом, но сам участок ограничен несколькими десятками дезоксирибонуклео-тидов.
Наиболее распространённые типы повреждения ДНК — одноцепочечные разрывы, апурин-апиримидиновые сайты и повреждённые основания — восстанавливаются с помощью эксцизионной репарации оснований [3]. Этот процесс инициируется ферментами ДНК-^-гликозилазами, которые гидролизуют связь между повреждён-
o
c ii nh h
Урацил Дезаминирование
A
(In
M---^
nh2
n
n h
n
I
ch3
N3-метиладенин Алкилирование
h n
G
o
4nh
Л
'n nh2
8-оксогуанин Окисление
1 1 o4,JC
o-
or -p=o o
o-
or 1
p=o
I
o-
n h
o Пурин o-, o oh
npi _ ip
or or
or
АП-сайт
Апуринизация
Рис. 1. Некоторые процессы, повреждающие ДНК, и наиболее распространённые модифицированные азотистые основания и нуклеотиды, возникающие в результате повреждения
ным основанием и дезоксирибозным фрагментом. У всех живых организмов имеется несколько ДНК-гликозилаз с разной субстратной специфичностью. Так, у человека известно 11 ДНК-гли-козилаз, а у E. coli — 8. Некоторые из них обладают весьма узкой субстратной специфичностью, удаляя из ДНК повреждённые основания только одного вида (например, урацил), другие же могут выщеплять разнообразные дефектные основания, относящиеся в целом к одному классу, например, окисленные пиримидины. Исходя из последовательностей и пространственных структур, ДНК-гликозилазы можно разделить на несколько семейств, совершенно не родственных друг другу. Тем не менее некоторые ДНК-гликозила-зы, принадлежащие к разным семействам, могут использовать в качестве субстрата ДНК, содержащую одно и то же повреждённое основание. Таким образом, они являют собой пример конвергентной эволюции белков, когда разные по происхождению ферменты выполняют одну и ту же функцию в клетке.
ПОВРЕЖДЕНИЕ ДНК И ЕГО БИОЛОГИЧЕСКИЕ ПОСЛЕДСТВИЯ
ДНК может модифицироваться в клетках как спонтанно, так и под влиянием различных агентов физической и химической природы [4, 5]. Возникновение неканонических элементов в ДНК (рис. 1) способствует гибели клетки или возникновению мутаций.
Под спонтанным повреждением ДНК понимают такое повреждение, которое в нормальных условиях постоянно имеет место в клетке, не подвергающейся воздействию внешних генотоксич-ных факторов (ионизирующей радиации, ультра-
фиолетового излучения или реакционноспособ-ных ксенобиотиков). К этому классу относятся процессы дезаминирования, утраты оснований, окислительного повреждения продуктами кислородного метаболизма и алкилирования эндогенными переносчиками метильной группы (8-аде-нозилметионин), также сюда можно включить возникновение неканонических пар и коротких петель при ошибках репликации. Разделение повреждений ДНК на спонтанные и идущие под действием экзогенных факторов достаточно условно, поскольку спектры возникающих при этом модификаций оснований ДНК в значительной степени перекрываются. Например, окислительное повреждение эндогенными метаболитами кислорода и продуктами радиолиза воды под действием ионизирующего излучения приводит к образованию одних и тех же дефектных оснований, а многие ксенобиотики присоединяются к азотистым основаниям ДНК по такому же механизму, как и внутриклеточные алкилирующие агенты. К числу повреждённых оснований, возникающих исключительно под действием внешних факторов, можно отнести продукты, появляющиеся в ДНК при облучении светом ультрафиолетового диапазона.
В качестве примера рассмотрим свойства 8-ок-согуанина (oxoGua) — наиболее хорошо изученного окисленного основания [6]. Он образуется в живой клетке при самых разных условиях, способствующих окислительному повреждению ДНК: при эндогенном окислении, дефиците систем антиоксидантов, ишемии, старении, облучении рентгеновским и у-излучением, обработке многими химическими соединениями, УФ-облу-чении в присутствии фотосенсибилизаторов и т.п. Уровень oxoGua в ДНК человека составляет
Рис. 2. Общая схема процесса эксцизионной репарации оснований у высших эукариот [3]
около 1 на 106 гуанинов и повышается в несколько раз при генотоксическом стрессе, например у курильщиков и людей, вдыхающих загрязнённый воздух. Повышенный базовый уровень oxoGua в ДНК связан с рядом заболеваний, причём это обычно наблюдается в поражённых органах и тканях: так, при болезни Паркинсона уровень oxoGua возрастает в чёрном веществе головного мозга.
В свободном виде нуклеотид oxodGuo находится преимущественно в син-конформации, поскольку в анти-конформации, характерной для нормальных нуклеотидов, имеет место стериче-ское отталкивание между атомом O8 и 5'-гидрок-сильной группой. Водородные связи с основанием Cyt в ДНК стабилизируют oxodGuo в анти-конформации, несмотря на стерический фактор. Однако при переходе oxodGuo в син-конформа-цию основание oxoGua способно образовывать водородные связи с основанием Ade. Поэтому oxoGua в ДНК-матрице при репликации вызывает включение не только dCMP, но и dAMP, тем самым способствуя мутации: пара G:C после включения dAMP и двух циклов репликации переходит в пару T:A. Мутагенез, индуцированный 8-oxoGua, может быть одним из шагов на пути к перерождению клетки в опухолевую.
ОБЩИЙ МЕХАНИЗМ ЭКСЦИЗИОННОЙ РЕПАРАЦИИ ОСНОВАНИЙ
Открытие дезаминирования Cyt в составе ДНК послужило толчком к поиску ферментов, способных удалять из ДНК основания Ura. В 1974 г. Т. Линдал выделил из E. coli "урацилгликозида-зу", обладающую способностью выщеплять Ura из ДНК, оставляя в ней АП-сайты. Впоследствии этот фермент — первый из всех обнаруженных ферментов, удаляющих повреждённые основания из ДНК, — получил название урацил-ДНК-^-гликозилазы (uracil-DNA ^-glycosylase, Ung).
Поскольку в большинстве случаев повреждение ДНК в живой клетке приводит к модификации азотистых оснований, исправление последних с помощью эксцизионной репарации оснований (ЭРО) представляет собой главный способ репарации ДНК в природе. Этот путь инициируется выщеплением модифицированного азотистого основания (или канонического основания в составе гетеродуплекса) одним из ферментов, принадлежащих к классу ДНК-^-гликозилаз (К.Ф. 3.2.2), которые катализируют гидролиз ^-гликозидной связи (рис. 2). Выщепление повреждённого элемента ДНК в виде основания отличает ЭРО от всех других типов репарации, в которых он удаляется в составе дезоксирибонуклео-
тидов или коротких олигонуклеотидов при участии других ферментов.
ДНК-гликозилазы делятся на несколько типов. В результате действия монофункциональных ДНК-гликозилаз в ДНК образуется первый промежуточный продукт ЭРО — апурин-апиримиди-новый (АП) сайт. АП-сайты также могут возникать за счёт спонтанной апуринизации дезокси-рибонуклеотидов в составе ДНК. Другие ДНК-гликозилазы, называемые бифункциональными, после удаления повреждённого основания могут вносить разрыв со стороны З'-фосфатной группы от образовавшегося АП-сайта. Такая активность называется АП-лиазной, продукты этой реакции не могут служить субстратами для
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.