УСПЕХИ СОВРЕМЕННОЙ БИОЛОГИИ, 2004, том 124, № 3, с. 260-271
УДК 575.174
ДНК-МАРКЕРЫ В ГЕНЕТИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ: ТИПЫ МАРКЕРОВ, ИХ СВОЙСТВА И ОБЛАСТИ ПРИМЕНЕНИЯ
© 2004 г. Г. Е. Сулимова
Институт общей генетики им. НИ. Вавилова РАН, Москва
Рассмотрены различные типы ДНК-маркеров, их достоинства и недостатки, области применения. Показано, что использование в качестве маркерных систем полиморфных последовательностей ДНК, созданных на основе ПЦР, позволяет решить проблему насыщения геномов маркерами и маркировать практически любые участки ДНК. Описан новый тип маркеров (БЫРв), объединяющий значительную часть ДНК-маркеров, ранее рассматриваемых как самостоятельные группы (ПЦР-ПДРФ, ББСР и др.). Проанализирована популярность различных типов молекулярных маркеров в периоды с 1966 по 2003 гг., дан прогноз на будущее.
Успехи генетических исследований обусловлены наличием информативных генетических маркеров. Первоначально в качестве генетических маркеров использовались морфологические (фе-нотипические) признаки, например, с использованием таких маркеров в 1913 г. была построена первая генетическая карта (карта генома бгозо-рЫ11а те1апо§аз!ег). Однако количество информативных маркеров этого типа ограничено. Кроме того, морфологические признаки могут иметь сложный характер наследования и часто зависят от условий внешней среды [56]. Развитие молекулярных методов исследований сделало возможным создание новых тест-систем, позволивших анализировать генетический полиморфизм на уровне продуктов генов (белковый или биохимический полиморфизм) и генетического материала клетки (полиморфизм ДНК).
БИОХИМИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ
Первые молекулярные маркеры были созданы на основе анализа белкового полиморфизма (биохимические маркеры). Использование нескольких сотен биохимических маркеров позволило оценить уровень генетического полиморфизма у более 2000 биологических видов (от микроорганизмов до человека) и разработать основные теоретические положения популяционной генетики [1, 43, 44, 60]. Однако анализ белков позволяет исследовать полиморфизм только белок-кодирую-щих последовательностей и только у экспресси-рующихся генов. Если учесть, что у высших эука-риот всего около 1% генома составляют белок-кодирующие последовательности, очевидно, что от внимания исследователей ускользает основная часть генома. При этом не рассматриваются такие функционально значимые участки, как про-моторные области, энхансеры, различные сайты регуляции, расположенные в интронах, нетранс-
лируемых областях генов, а также вне генов, часто на значительном расстоянии от кодирующей последовательности.
Возможности указанного метода лимитируются также низким уровнем белкового полиморфизма в популяциях домашних животных, птиц, культурных растений [19, 41, 91], ограничениями в выборе биологического материала и времени его сбора.
Более перспективным представляется использование в качестве маркерных систем полиморфных нуклеотидных последовательностей ДНК, позволяющих тестировать генетический полиморфизм непосредственно на уровне генов, а не на уровне продуктов генов, как в случае использования метода белкового полиморфизма. ДНК-маркеры позволяют решить проблему насыщения генома маркерами и маркировать практически любые участки ДНК, в том числе некодирующие. Помимо этого данная маркерная система дает возможность использовать для анализа любые ткани и органы, независимо от стадии развития организма, и имеет целый ряд преимуществ по сравнению с другими типами маркеров (таблица).
ДНК-МАРКЕРЫ, ОСНОВАННЫЕ НА АНАЛИЗЕ РЕСТРИКЦИОННОГО ПОЛИМОРФИЗМА
Открытие и выделение рестрицирующих эн-донуклеаз (рестриктаз) [16], расщепляющих ДНК в участках со строго определенной последовательностью, позволило разработать маркеры на основе анализа рестрикционного полиморфизма ДНК.
Полиморфизм длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ, англ. RFLP - Restriction Fragment Length Polymorphism) впервые был использован как генетический маркер в 1974 г. при идентифи-
Свойства ДНК маркеров
Свойство
Преимущество
Полезные свойства
Методическое удобство
Отсутствие ограничений в количестве маркеров
Возможность тестирования любых последовательностей генома Повсеместность распространения
Возможность анализа материнского типа наследования (митохондриальная ДНК) Возможность анализа отцовского типа наследования (У-хромосома) Стабильность наследования Отсутствие плейотропного эффекта Множественность аллелей
Информативность о природе генетических изменений Возможность проведения ретроспективных исследований Возможность определения в любых тканях Возможность определения на любых стадиях развития Длительность хранения образцов ДНК
Возможность использования гербарного материала, ископаемых остатков и т.п
Отсутствие ограничений в числе маркеров на образец
Наличие маркеров для белок-кодирующих последовательностей
Наличие маркеров для некодирующих последовательностей (интронные, межгенные, регуляторные области и т.п.)
Наличие маркеров для повторяющихся последовательностей
кации термочувствительной мутации в геноме аденовируса [37]. Широкое применение вариантов полиморфизма ДНК в качестве генетических маркеров началось с 1980 г. после выхода основополагающей работы [22], в которой были изучены свойства ПДРФ как генетического маркера, дано теоретическое обоснование его использования и предложен метод оценки уровня информативности (PIC - polymorphism information content). Самими авторами метод был с успехом применен для картирования генома человека [22]. ПДРФ используют для анализа полиморфизма конкретных локусов (генов). Способ анализа ПДРФ сводится к обработке ДНК рестриктазами с последующим электрофоретическим разделением полученной смеси и определением длин рестрик-ционных фрагментов после блот-гибридизации со специфическим меченым зондом. Поскольку рестрицирующие эндонуклеазы имеют строго специфические места расщепления, генетические различия в нуклеотидной последовательности ДНК между индивидуумами (т.е. полиморфизм на уровне ДНК) приведут к различному распределению сайтов рестрикции вдоль соответствующих молекул ДНК и получению продуктов рестрикции с различной длиной гомологичных фрагментов. Таким образом, полиморфизм ДНК будет тестироваться как ПДРФ. Подробнее с методологией ПДРФ можно ознакомиться в работах [2, 10, 20, 21].
Основной причиной возникновения полиморфизма ДНК первоначально считались точковые мутации (а также микроделеции и инсерции), за-
трагивающие сайты узнавания тех или иных эн-донуклеаз рестрикции [22]. В последующих работах спектр возможных причин был расширен, и в настоящее время основная роль отводится таким факторам, как крупные делеции и вставки [89], трансверсии, транслокации, транспозиции мобильных генетических элементов [77] и т.п. Кроме того, некоторые рестриктазы не способны расщеплять ДНК, если сайт узнавания содержит один или несколько метилированных цитозино-вых остатков. Такие ферменты также могут выявить полиморфизм, если имеются вариации в характере метилирования (цит. по [9]).
С использованием ПДРФ-маркеров были получены первые успешные результаты по построению молекулярно-генетических карт многих видов растений и животных, накоплены обширные сведения о генетическом полиморфизме различных организмов, выявлены ассоциации с хозяйственно-полезными признаками [20, 21, 26, 76, 78, 81]. Важным достоинством данного типа маркеров является высокая воспроизводимость результатов, а также кодоминантный тип наследования. ПДРФ-локусы могут обладать множественными аллелями, что повышает их информативность. ПДРФ-анализ митохондриальной ДНК и кластера генов, кодирующих рибосомные РНК (рДНК), широко используется в популяционной генетике, биогеографических и филогенетических исследованиях [18]. Высокий консерватизм ПДРФ-маркеров позволяет использовать их при сравнительном картировании родственных видов. Например,
появление детальных генетических карт многих растений позволило сравнить между собой ряд геномов, благодаря использованию общего набора ПДРФ-зондов [63].
ДНК-фингерпринт (синоним - "геномная дактилоскопия") позволяет исследовать полиморфизм множества локусов повторяющихся последовательностей (мультилокусный анализ). Анализ проводится тем же способом, что и в случае ПДРФ, но в качестве специфического гибридиза-ционного зонда используются последовательности повторяющихся групп - минисателлитов. Ми-нисателлиты диспергированы по геному и представляют собой последовательности, состоящие из многократно повторенной единицы ("мотива" или "коровой" последовательности) длиной от 9 до 100 и более п.н. (тандемно повторяющиеся последовательности). Отдельные последовательности отличаются друг от друга общей длиной (числу повторов "мотива"), а также некоторыми вариациями в нуклеотидной последовательности "мотива". Использование "коровых" последовательностей в качестве зондов при гибридизации позволяет выявлять множество участков рест-рикционного полиморфизма и получать высокоспецифическую картину гибридизации геномной ДНК, характерную для конкретного индивида (особи). Показано, что с помощью данного подхода в геноме млекопитающих можно выявить более 30 высокополиморфных локусов, что достаточно для индивидуальной идентификации человека, растений, животных [6, 48, 87]. Многие "коровые" минисателлитные последовательности высококонсервативны и могут быть использованы для выявления аналогичных последовательностей в ДНК самых разных организмов [6, 47, 87].
Описаны минисателлитные зонды не только универсального характера, но и локус-специфич-ные [42]. Локус-специфичные мини сателлиты можно получить также клонированием экстрагированных из геля фрагментов, дающих отдельную полосу на фингерпринте ДНК [96]. Моноло-кусные минисателлиты высокоинформативны и могут быть эффективно использованы для анализа групп сцепления генов.
Основными механизмами возникновения и поддержания полиморфизма в минисателлитах считаются неравный кроссинговер и генная конверсия. При этом высокую вариабельность (нестабильность) минисателлитов связывают не с внутренним свойством повторяющейся последовательности, а с ини
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.