БИОХИМИЯ, 2014, том 79, вып. 2, с. 154 - 168
УДК 577.152.277
ДНК-МЕТИЛТРАНСФЕРАЗА 3а СПОСОБНА ИНГИБИРОВАТЬ ВИРУС ГЕПАТИТА В ПОСРЕДСТВОМ МЕТИЛИРОВАНИЯ Х-ПРОМОТЕРА, СПЕЦИФИЧНОСТЬ КОТОРОГО ОБЕСПЕЧИВАЮТ ЦИНКОВЫЕ ПАЛЬЦЫ*
© 2014 Л. Ксиронг123, Л. Руи1, Й. Ксяоли1, Х. Киуян1, T. Бикуи1, З. Сибо1, З. Наишуо12**
1 Laboratory of Molecular Immunology, State Key Laboratory of Genetic Engineering, School of Life Sciences, Fudan University, Shanghai 200433, China; E-mail: holyinshanghai@163.com
2 Shanghai Xinxing Medicine Co., LTD, Shanghai 200135, China; E-mail: naishuoz@sina.com
3 Institute of Biomedical Sciences, Fudan University, Shanghai 200433, China; fax: 86(21)5566-4032, E-mail: lixirong@fudan.edu.cn
Поступила в редакцию 02.09.13 После доработки 11.11.13
Изучали вопрос: вызывает ли ДНК-метилтрансфераза 3а (Dnmt3a), специфичная к Х-промотеру (XP) вируса гепатита B, эпигенетическую супрессию последнего. C-конец ДНК-метилтрансферазы 3a (Dnmt3aC) был слит с пептидом, содержащим шесть цинковых пальцев и обладающим сродством к X-промотеру, в результате чего была получена химерная форма ДНК-метилтрансферазы, обозначаемая далее XPDnmt3aC. Специфичность связывания и метилирующей активности химерной XPDnmt3aC оценивали с помощью метода задержки в геле и метода специфичной к метилированию ПЦР, соответственно. Активность Х-промотера и экспрессия HBV были значительно снижены в клетках HepG2, трансфецированных плазмидой pXPDnmt3aC. Инъекция химерной XPDnmt3aC в трансгенные HBV мыши (TgHBV) также приводила к значительному ин-гибированию, что выражалось в понижении уровня поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg) в сыворотке крови и уменьшению вирусной нагрузки. Таким образом, химерная XPDnmt3aC специфически подавляет вирус гепатита B посредством сайт-специфичности метилирования ДНК, обеспечиваемой цинк-фингерными пептидами. Полученные результаты свидетельствуют о возможности эпигенетической регуляции заболеваний, ассоциированных с гепатитом В.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: вирус гепатита B, X-промотер, ДНК-метилтрансфераза, цинковые пальцы, сайт-специфическое метилирование ДНК, регуляция генов, метилирование X-промотера приводит к снижению уровня экспрессии HBV.
Вирусом гепатита B (HBV) заражено более 350 млн человек по всему миру, он является основной причиной цирроза печени и гепатоцел-люлярной карциномы (hepatocellular carcinoma, HCC) [1]. В настоящее время для лечения хронической HBV инфекции применяют интерфе-рон-а и аналоги нуклеотидов, однако эти антивирусные препараты редко приводят к элиминации вируса и полному выздоровлению [2, 3]. Более того, пролонгированное использование аналогов нуклеотидов, таких как ламивудин, аде-фовир дипивоксиал и этекавир, приводит, как
* Первоначально английский вариант рукописи был опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow), Papers in Press, BM 13-249, 12.01.2014.
** Адресат для корреспонденции.
правило, к развитию лекарственной устойчивости [3]. Ковалентно-замкнутая кольцевая ДНК вируса гепатита B сохраняется в ядрах клеток хозяина и обусловливает повторное развитие инфекции по окончании антивирусной терапии или развитии устойчивости. В связи с этим, разработка новых подходов к борьбе с вирусом гепатита В является актуальной задачей.
Гиперметилирование CpG последовательностей в промотерах множества генов, как правило, приводит к снижению уровня транскрипции [4, 5]. Метилирование промотеров некоторых вирусных генов играет роль в обеспечении латентности и длительного сохранения вируса в организме и часто наблюдается при вирусных заболеваниях человека, в том числе таких, как вирус Эпштейн—Барра (EBV) [6], вирус иммуно-
дефицита человека 1 типа (И1У-1) [7] и вирус гепатита В (ИВУ) [8, 9]. Было показано, что повышение степени метилирования СрО-динуклео-тидов в кольцевой вирусной ДНК ассоциировано со снижением количества ДНК ИВУ в сыворотке крови и приводит к подавлению реплика-тивной активности вируса [8, 9]. В связи с этим, исследование регуляторной роли специфического метилирования ДНК в процессе подавления репликации вируса гепатита В представляет значительный интерес.
Обратимость эпигенетических модификаций способствовала разработке лекарственных препаратов, мишенью которых являются ферменты, катализирующие эпигенетические модификации в процессе развития раковых заболеваний у человека [10]. Одобренные Федеральным Управлением по надзору за качеством продуктов питания и лекарственных средств Правительства США эпигенетические препараты, как правило, действуют на весь геном, поскольку они чрезвычайно неспецифичны. Первые исследования адресного метилирования ДНК анализировали ДНК-метилтрансферазу, генетически сшитую с последовательностями специфических ДНК-связывающих белков, таких как цинк-фингерные белки, которые играли роль адресующего домена, обеспечивая метилирование цитозина в промотере-мишени, интегрированном в геном. В результате ученые наблюдали наследуемое подавление экспрессии генов, как, например, в случае с ингибированием простого вируса гепреса 1 типа (ЖУ-1) [11—16]. Насколько нам известно, специфическое метилирование ДНК не использовали для подавления вируса гепатита В.
Х-промотер (ХР) в геноме вируса гепатита В, перекрывающийся с энхансером I и СрО островком II, является чрезвычайно активным [17], свидетельствуя в пользу предположения о возможности регуляции его активности за счет метилирования ДНК. В настоящей работе мы оценили влияние специфического метилирования Х-промотера, направляемого цинк-фингерным белком, на экспрессию вируса гепатита В. ДНК-ме-тилтрансфераза 3а может специфически метилировать СрО-динуклеотиды в 5'-фланкирующей области и в экзонах генов [18]. ^-концевой регу-ляторный домен Бпш13а обеспечивает ее субстрат-специфичность. Для снижения токсичности, обусловленной неспецифичностью метилирования, С-концевой домен ДНК-метилтрансфе-разы 3а (Бпш13аС) использовали для создания специфичной метилтрансферазы [11—15]. Ре-комбинантная метилаза снижала уровень экспрессии вируса гепатита В в клетках ИерО2 и в трансгенных ИВУ мышах (М^ИВУ).
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Плазмиды. Все праймеры, использованные в работе, были синтезированы в «Invitrogen Corp.» (Китай) (табл. 1). Репортерная плазмида с X-про-мотером — pXPLuc, содержащая фрагмент с 956 по 1369 нуклеотид генома HBV (GenBank accession no. AY306136.1), была получена путем модификации вектора pGL3-Basic luciferase reporter vector («Promega», Китай) с использованием праймеров к X-промотеру (табл. 1). Химерная метилтрансфераза схематично изображена на рис. 1, г. Пептиды, содержащие шесть цинковых пальцев, специфически связывающиеся с X-про-мотером, (XPZF) выбирали с помощью программного обеспечения ZF Tools [19]; селекцию проводили с учетом расстояния между сайтами узнавания Dnmt3a и сайтами метилирования ДНК, уникальность сайтов связывания определяли с использованием программного обеспечения blastn NCBI [16, 19]. Для определения последовательности, узнаваемой цинковыми пальцами, использовали метод задержки в геле (Electrophoretic mobility shift assay (EMSA)) (данные не представлены). Последовательность, с которой избирательно связывается XPZF, расположена в участке перекрывания X-промотера и CpG островка II (нт 1302~1319) (рис. 1, а—в). XPZF синтезировали («Jierui Biotech company», China) и амплифицировали с прямым прайме-ром, кодирующим ^-концевую метку Flag tag (DYKDDDDK) и сигнал ядерной локализации (PKKKRKV) (рис. 1, г), после чего клонировали в вектор pcDNA3.1(+) («Invitrogen»). Для амплификации С-концевого фрагмента ДНК-метил-трансферазы 3a (нт 2217—3074; GenBank: NM_ 175629.1) использовали с pcDNA3/Flag-DNMT3A (из лаборатории Arthur D. Riggs) в качестве матрицы и прямой праймер, кодирующий ^-кон-цевой гибкий линкер (Gly4Ser)2 (рис. 1, г и д). Полученный фрагмент лигировали с фрагментом, кодирующим XPZF, в результате чего получили конструкт, экспрессирующий рекомбинант-ную ДНК-метилтрансферазу, pXPDnmt3aC. Способную к репликации HBV плазмиду сконструировали согласно протоколу J. Cui [20] с помощью ПЦР амплификации перекрывающихся фрагментов, соответствующих 1.3 генома вируса гепатита В; полученная плазмида содержала внутренний HBV-промотер, необходимый для транскрипции прегеномной РНК (пгРНК).
Культуры клеток и трансфекция. Использовали клеточные линии, полученные из Cell Bank Center Института Shanghai Institutes for Biological Sciences. Клетки HepG2 растили в среде RPMI1640 («Gibco», Китай), содержащей 10%-ную феталь-ную бычью сыворотку («Gibco»), инактивиро-
Таблица 1. Праймеры, использованные в работе
Амплификация Название гена или промотера Праймер Точка начала (НБУнт) Последовательность (5'—3') Размер (п.о.)
Промотер Х-промотер прямой обратный 956 1369 ТОССТОТАААТАОАССТАТТОАТТО АООАООТОТАТТТССОАОАОАОО 414
Ген Бпш13аС прямой обратный 2217 3074 С САО СТОАОААОАО ОААО САСАСАСОСААААТАСТСС 888
Flag-XPZF прямой обратный ОАТТАСААООАТОАСОАСОАТААОСССАА- ОЛАОЛАОСОСЛАООТОСТООЛАССООО- CОЛЛЛЛЛC ОСТООТТТТТТТОССООТ 570
СЫР участок мишени в Х-промотере прямой обратный 1170 1384 ТСТСТвССААвТвТТТвСТв СТАОСАОССАТООЛЛАООАО 215
НБУ1.3 фрагмент № 1 Р1 Р2 1037 2357 ОТООТТАТССТОССТТЛАТО СТСОТСОТСТЛАСЛАСАОТА 1321
фрагмент № 2 Р3 Р4 2333 704 вАААСТАСТвТТвТТАвАСвАС СвААССАСТвААСАААТв 1532
фрагмент № 3 Р5 Р6 527 2073 АСвАвТССТвСТСААввААС вСТТвССТвАвТвСТвТАТв 1547
ПЦР в реальном времени фрагмент НБУ НБУ totF НБУ totR 1816 1923 вСААСТТТТТСАССТСТвССТА АОТЛАСТССАСАОТАОСТССЛЛАТТ 108
Ген ген С прямой обратный 1901 2452 АТООАСАТТООСССОТАТА ТААСАТТвАвАТТСССвАвАТТ 552
ОАРБН прямой обратный 1901 2452 СААввТСАТССАТвАСААСТТТв ОТССАССАСССТОТТОСТОТАО 496
Бисульфитное секвенирование Х-промотер левый М праймер правый М праймер 183 384 ААТТТТТАТТТСвТТвТТСввТААС ААТТАТСвАТТССвАТАААТТТСв 202
левый и праймер 185 ТТТТТАТТТТвТТвТТТввТААТвв 201
правый и 385 АААТТАТСААТТССААТАААТТТСАСТ
праймер
IL-4R промотер левый М праймер правый М праймер 1459 ТТАТТТООЛААТТТАОТТОООАОТС ЛАСОТЛАЛЛАЛААССЛЛАЛААСО 193
левый и праймер 1460 ТАТТТввАААТТТАвТТвввАвТТв 192
правый и ААСАТААААААААССААААААСАСТ
праймер
а
о
«S 80
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.