БИОХИМИЯ, 2011, том 76, вып. 1, с. 76 - 85
УДК 577.212.3
ДНК-ПОЛИМЕРАЗА i МЛЕКОПИТАЮЩИХ СРЕДИ УЧАСТНИКОВ СИНТЕЗА ДНК ЧЕРЕЗ ПОВРЕЖДЕНИЕ
Обзор © 2011 г. Л.В. Генинг
Учреждение РАН Институт молекулярной генетики РАН, 123182 Москва, пл. Академика Курчатова 2; факс: (499)196-0221, электронная почта: geni@img.ras.ru
Поступила в редакцию 02.08.10 После доработки 20.10.10
Рассматриваются свойства некоторых специализированных ДНК-полимераз, участвующих в синтезе ДНК через повреждение. Особое внимание уделено тому, как эти свойства реализуются in vivo. Из всех участников синтеза через повреждение ДНК-полимераза i (Poli) млекопитающих обладает самыми необычными свойствами и в высшей степени склонна к некорректному синтезу ДНК. На основании имеющихся данных делается предположение, способное объяснить, как клеткам млекопитающих удается использовать необычные свойства Poli для преодоления повреждений ДНК и в то же время избежать реализации ее мутагенного потенциала.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: синтез ДНК через повреждения, склонная к ошибкам ДНК-полимераза, ДНК-поли-мераза i.
СИНТЕЗ ДНК ЧЕРЕЗ ПОВРЕЖДЕНИЕ В КЛЕТКАХ ЭУКАРИОТ
Структурная организация живой клетки, а также физические и биохимические свойства отдельных ее элементов не позволяют полностью защитить ДНК, находящуюся в ней, от многочисленных повреждающих агентов, которые действуют на клетку извне (например, радиация, канцерогенез и УФ-спектр солнечного излучения) или находятся внутри нее (например, кислород в высокоактивной форме). Несмотря на то что клетки благодаря наличию ряда специальных молекулярных механизмов в основном способны ликвидировать повреждения, возникающие в ДНК, некоторые из этих поврежде-
Принятые сокращения: Poll, Poln, PolZ, PoIk, RevI, Polß, PolX, Pola, PolS, Pole — ДНК-полимеразы i, n, Z, k, RevI, ß, X, a, 8, e соответственно; csTT — cis-syn-тимин-ти-миновый димер; cisPt-GG — цисплатиновый аддукт; HIF1 — hypoxia-inducible factor 1; HRE — hypoxia response element; PCNA — proliferating cell nuclear antigen; RFC — replication factor C; RPA - replication protein A; PARP1 - poly(ADP-ribose) polymerase 1; APE1 — apurinic/apyrimidinic endonu-clease 1; PNK — polynucleotide kinase; XP-V — Xeroderma pigmentosum variant V; XRCC1 — X-ray repair complementing defective repair in Chinese hamster cells 1; PIP1, PIP2 — PCNA interecnion protein box.
ний сохраняются и могут блокировать репликацию. Для снятия блокировки и продолжения синтеза растущей цепи ДНК в клетках существует также ряд молекулярных механизмов, обеспечивающих синтез ДНК через повреждение (translesion synthesis), не все детали которых до сих пор выяснены. В последние годы, в связи с тем что изучение этих механизмов имеет большое значение для биологии и медицины, наметился существенный прогресс в области исследования репликации поврежденной ДНК и изучения ДНК-полимераз, участвующих в синтезе ДНК через повреждение.
Репликация ДНК, как известно, это сложный процесс, результатом которого является эффективное и очень точное копирование материнских цепей ДНК. Репликативные ДНК-по-лимеразы представляют собой ферменты, которые полностью соответствуют этому процессу, и их активные центры приспособлены для копирования неповрежденной ДНК. Поэтому многие повреждения ДНК являются непреодолимым препятствием для этих ДНК-полимераз, что может привести к остановке репликации и гибели клетки. Способ решения этой проблемы выбирается регуляторными системами клетки в зависимости от характера повреждения и сложности его преодоления. Так, для преодоления
межцепочечных сшивок в ДНК клетки эукариот используют три различных процесса: репарацию с вырезанием нуклеотидов, синтез ДНК через повреждение и гомологичную рекомбинацию. Нарушение координации этих процессов в результате мутации в одном из регуляторных генов нередко приводит к тяжелым генетическим заболеваниям, например к анемии Фанкони. Это заболевание характеризуется нарушением генетической стабильности в клетках. Как следствие, у пациентов помимо анемии возникает ряд других характерных симптомов и развивается рак в раннем возрасте [1].
Межцепочечные сшивки ДНК представляют собой одно из наиболее сложных и достаточно редких повреждений, преодолеваемых при репликации. Они затрагивают обе цепи ДНК и делают невозможным их расплетание, блокируя тем самым как репликацию, так и транскрипцию. Более распространены повреждения, затрагивающие одну из цепей ДНК. Для их преодоления часто бывает достаточно только синтеза ДНК через повреждение, который осуществляется одной или несколькими специализированными ДНК-полимеразами. Эти ферменты благодаря особому строению их каталитических центров обладают способностью синтезировать ДНК с использованием матриц, содержащих поврежденные участки, но из-за этого не обладают способностью к точному синтезу на матрице, не содержащей повреждений, и часто ошибаются при ее копировании. Поэтому такие ферменты иногда называют «склонными к ошибкам ДНК-полимеразами» [2]. Однако часть этих ДНК-полимераз способна преодолевать повреждения, блокирующие репликацию, и причем встраивать нуклеотиды, восстанавливающие информацию, содержавшуюся в матрице до повреждения. Следовательно, название «склонные к ошибкам ДНК-полимеразы» не всегда справедливо. Очевидно, что функция этих ферментов состоит не в создании ошибок, а в поддержании стабильности генома. В самом деле, в живой клетке с помощью сложной системы регуляции число ошибок, генерируемых «склонными к ошибкам ДНК-полимеразами», сводится к минимуму, а способность к безошибочному преодолению повреждений ДНК используется как один из основных способов поддержания стабильности генома.
Одним из наиболее ярких примеров безошибочного синтеза ДНК через повреждение является преодоление при репликации сЛТ, осуществляемое ДНК-полимеразой Ро1п. Данный фермент обладает способностью преодолевать это повреждение ДНК с такой же эффективностью и точностью, с какой он копирует неповрежден-
ную матрицу, содержащую тимины [3]. Poln преодолевает суГТ путем встраивания нуклеотидов напротив повреждения и затем продолжает синтез после встроенных нуклеотидов. Однако во многих случаях синтез ДНК через повреждение требует последовательного действия двух или нескольких ДНК-полимераз. При этом одна из них встраивает нуклеотид напротив повреждения, а вторая продолжает синтез после встроенного нуклеотида. Выяснилось, что некоторые ДНК-полимеразы встраивают нуклеоти-ды напротив повреждения. Такие ДНК-полиме-разы называются инсертерами (insert — вставлять), в то время как другие ДНК-полимеразы продолжают синтез ДНК через повреждение. Эти ферменты принято называть экстендерами (extend — продолжать).
Эксперименты по изучению синтеза ДНК через повреждение с участием различных специализированных ДНК-полимераз in vitro показали, что функцию инсертеров может выполнять большинство специализированных ДНК-полимераз, тогда как функцию экстендера выполняет в основном ДНК-полимераза Z [4]. Этот фермент способен эффективно элонгиро-вать праймер, содержащий некомплементарную пару оснований, некодирующий или дестабилизирующий заместитель на З'-конце. В то же время PolZ с очень низкой эффективностью удлиняет праймер, содержащий на З'-конце повреждение, внесенное самой полимеразой. На основании этого и ряда других свойств PolZ было предположено, что она выступает в роли экс-тендера в том случае, когда синтез ДНК через повреждение выполняется двумя ДНК-полиме-разами [4]. Более того, в экспериментах с клетками человека, в которых экспрессия PolZ, Poln и ДНК-полимеразы к подавлялась с помощью РНК-интерференции, было показано, что PolZ может играть роль экстендера в синтезе ДНК через повреждение с участием трех или даже четырех ДНК-полимераз [4].
Необходимо отметить, что свойства отдельных ДНК-полимераз, изученные in vitro с использованием гомогенных препаратов, могут существенно отличаться от свойств, которые ферменты проявляют в живой клетке. Так, например, каждая из ДНК-полимераз Poln и PoIk сама по себе способна in vitro осуществлять синтез через такое повреждение ДНК как cisPt-GG. Но эксперименты по подавлению экспрессии трех ДНК-полимераз, PolZ, Poln и PoIk, с помощью РНК-интерференции в культуре клеток человека показали, что в синтезе через это повреждение участвуют все три перечисленные ДНК-полимеразы [4]. При этом Poln и PoIk служат, скорее всего, инсертерами и могут взаимо-
заменяться, поскольку подавление экспрессии одной из двух ДНК-полимераз незначительно влияет на эффективность синтеза ДНК через повреждение. Если же одновременно блокировать экспрессию обеих ДНК-полимераз, то эффективность синтеза ДНК через повреждение снижается сразу в 5 раз. При этом, скорее всего, в клетках человека нет достойной замены PolZ для преодоления cisPt-GG, поскольку подавление экспрессии гена этой ДНК-полимеразы вызывает пятикратное снижение эффективности синтеза ДНК через повреждение. Пока нет ответа на вопрос, почему клетка использует три ДНК-полимеразы для преодоления повреждения, которое две из них могут преодолевать in vitro самостоятельно. Но можно предположить, что использование в качестве экстендера PolZ, которая обладает большей точностью синтеза и аккуратнее, чем Poln и PoIk, элонгирует неспа-ренные З'-концы ДНК, позволяет избежать мутагенного действия Poln и PoIk.
Исследования взаимодействий ДНК-поли-мераз между собой и с другими белками, участвующими в синтезе ДНК через повреждение, показали, что система регуляции активности отдельных ДНК-полимераз организована достаточно сложно. При этом до сих пор до конца не выяснено, каким образом в процессе репликации клеткам удается подключить одну или несколько нужных специализированных ДНК-по-лимераз для преодоления повреждения с максимальной эффективностью и точностью. Кроме того, необходимо удалить специализированные ДНК-полимеразы из репликативной вилки после преодоления повреждения и создать условия для продолжения синтеза ДНК репликативны-ми ДНК-полимеразами. Последнее действие необходимо, поскольку все ДНК-полимеразы, участвующие в синтезе ДНК через повреждение, малоэффективны и допускают большо
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.