научная статья по теме ДНК-ШАФФЛИНГ ГЕНА РЕЗИСТЕНТНОСТИ PTR ПРИВОДИТ К УВЕЛИЧЕНИЮ ВЫХОДА ПРИСТИНАМИЦИНА В КЛЕТКАХ STREPTOMYCES PRISTINAESPIRALIS Биология

Текст научной статьи на тему «ДНК-ШАФФЛИНГ ГЕНА РЕЗИСТЕНТНОСТИ PTR ПРИВОДИТ К УВЕЛИЧЕНИЮ ВЫХОДА ПРИСТИНАМИЦИНА В КЛЕТКАХ STREPTOMYCES PRISTINAESPIRALIS»

ГЕНОМИКА, ТРАНСКРИПТОМИКА

УДК 577.29

ДНК-ШАФФЛИНГ ГЕНА РЕЗИСТЕНТНОСТИ ptr ПРИВОДИТ К УВЕЛИЧЕНИЮ ВЫХОДА ПРИСТИНАМИЦИНА В КЛЕТКАХ Streptomyces pristinaespiralis#

© 2015 г. Q. C. Jin1, N. Shena, H. Yin12, Y. Yang1, Z. H. Jin12*

1School of Biological and Chemical Engineering, Ningbo Institute of Technology, Zhejiang University, Ningbo, 315100, China 2Department of Chemical and Biochemical Engineering, Zhejiang University, Hangzhou, 310027, China

Поступила в редакцию 14.07.2014 г. Принята в печать 17.07.2014 г.

С целью увеличить выход пристинамицина мы выбрали шесть гомологичных генов ptr из высокопродуктивных штаммов Streptomyces pristinaespiralis для проведения ДНК-шаффлинга и, получив желаемый вариант, рассмотрели возможную причину измененной активности белкового продукта отселектированного гена ptr, опираясь на сравнительный анализ аминокислотных последовательностей. Самый высокий выход пристинамицина, 0.12 г/л, в штамме sps16, полученном ДНК-шаффлингом, был в 6 раз выше, чем в штамме-предке ATCC 25486. По данным секвенирования гена ptr из штамма sps16 в кодируемом им белковом продукте появилось 5 мутаций: H16P, N63D, T75P, Q107R и P435A, — причем две из них, N63D и T75P, расположены во втором из 14 трансмембранных сегментов (TMS). Согласно предсказанной вторичной структуре кодируемого белка, мутации на N-конце приводят к укорочению соответствующей а-спи-рали, а мутация по С-концу удлиняет спираль. Таким образом, комбинирование ДНК-шаффлинга с геномным шаффлингом — эффективная стратегия селекции, позволяющая повышать выход антибиотиков направленной эволюцией целевых генов.

Ключевые слова: Streptomyces pristinaespiralis, биосинтез пристинамицина, ДНК-шаффлинг, ген ptr.

DNA SHUFFLING OF ptr RESISTANCE GENE LEADS TO IMPROVED PRISTINAMYCIN PRODUCTION IN Streptomyces pristinaespiralis, by Q. C. Jin1, N. Shen1, H. Yin1'2, Y. Yang1, Z. H. Jin1'2* (1School of Biological and Chemical Engineering, Ningbo Institute of Technology, Zhejiang University, Ningbo, 315100 China,*e-mail: zhking@nit.zju.edu.cn; 2Department of Chemical and Biochemical Engineering, Zhejiang University, Hangzhou, 310027 China). In order to enhance pristinamycin production, six homologous ptr genes from high pristinamycin-producing strains of Streptomyces pristinaespiralis were selected for DNA shuffling, and the reason for the altered activities of the shuffled ptr gene was speculated by sequence alignment. The highest pristinamycin yield of 0.12 g/L was achieved with a sixfold increase in strain sps16 obtained by DNA shuffling when compared to ancestral strain ATCC 25486. Sequence analysis of the ptr gene variant from the sps16 strain indicated that five mutations (H16P, N63D, T75P, Q107R, and P435A) were introduced into the gene, two of them (N63D and T75P) located in the second of the 14 transmembrane segments (TMS). Prediction of the secondary structure of the gene product indicated that mutations at the N-terminus resulted in the shortening of the corresponding а-helix, while the mutation at the C-terminus lengthened the helix. In conclusion, combination of DNA shuffling with genome shuffling is an effective breeding strategy for increasing the antibiotic yield by directed evolution of target genes.

Keywords: Streptomyces pristinaespiralis, pristinamycin biosynthesis, DNA shuffling, ptr gene.

DOI: 10.7868/S0026898415020056

Streptomyces pristinaespiralis продуцирует при-стинамицин (P), состоящий из двух структурно различных антибиотиков (пристинамицин I, PI, и пристинамицин II, PII), которые синтезируются координационно и действуют синергетически, проявляя бактериостатическую активность [1]. В

# Статья представлена на английском языке.

* Эл. почта: zhking@nit.zju.edu.cn

связи с тем, что клетки S. pristinaespiralis продуцируют антибиотики, в них должны работать "спасительные" механизмы резистентности, обеспечивающие толерантность к широкому спектру токсичных для них продуктов. Показано, что ген пристинамицинустойчивости (ptr) придает клеткам резистентность к ряду соединений, включая два структурно отличающихся антибиотика, PI и PII, смесь природных пристинамицинов и ри-

7

289

фампицин [2]. Однако этой резистентности оказывается недостаточно для выживания S. pristin-aespiralis, когда концентрация антибиотика намного превосходит уровень толерантности. Дело в том, что в ходе ферментации S. pristinaespiralis при высокой концентрации экзогенного пристинами-цина происходит торможение как роста мицелия, так и биосинтеза пристинамицина [3]. Недавно показано, что введением гена множественной лекарственной устойчивости ptr можно повысить резистентность бактерий к пристинамицину, а также повысить выход антибиотика в S. pristinaespiralis [4].

Повышения продукции антибиотика добиваются путем увеличения пристинамицинрезистент-ности S. pristinaespiralis, используя для этого технологию геномного шаффлинга, которая позволяет получать много штаммов с высоким уровнем биосинтеза пристинамицина [5]. Эти высокопроизводительные штаммы генетически отличаются от предковых геномным шаффлингом, хотя детальной информации по генетике, объясняющей увеличение резистентности этих штаммов, пока нет. По этой причине есть вероятность получать еще более высокие уровни пристинамицина в S. pristinaespiralis, если использовать эти штаммы для ДНК-шаффлинга гена резистентности ptr. ДНК-шаф-флинг — это вид технологии направленного изменения генома, или искусственной эволюции, которая имитирует природный эволюционный процесс in vitro — в лабораторных условиях [6]. Удачный пример — шаффлинг ампицилинрезистентного гена, в результате чего возросла устойчивость Escherichia coli к антибиотикам [7].

В данном исследовании, с целью генерировать библиотеку гибридных генов ptr, для шаффлинга использовали шесть гомологичных генов ptr из высокопродуктивных по пристинамицину штаммов S. pristinaespiralis. Полученные в результате ДНК-шаффлинга ("шаффлированные", или перетасованные) гены ptr затем трансформировали в S. pristinaespiralis ATCC25486 и оценивали выход синтезируемого пристинамицина. В штамме sps16 достигнут самый высокий уровень пристинамици-на — 0.12 г/л, что в 6 раз превосходит исходный. С целью понять возможные причины измененной активности "шаффлированного" гена ptr в самом высокорепродуктивном штамме мы сравнили последовательности, проанализировали консервативные участки и вторичную структуру белков, кодируемых этим геном и его предком.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Материалы. Шесть высокопродуктивных по пристинамицину рекомбинанта: F416, F2111, F213, F618, F303 и F212, полученных геномным шаффлингом предкового штамма S. pristinaespiralis ATCC 25486 [8], хранили в 40%-ном (v/v) глицерине при —80°C. Штамм Escherichia coli DH5a ис-

пользован в качестве хозяйских клеток для клонирования. E. coli ET12567 с конъюгативной плазми-дой pUZ8002 использовали в качестве донора для межродовой конъюгации [9]. Вектор pMD19-T ("Takara", Япония) использован для лигирования и амплификации гена резистентности ptr в E. coli DH5a; сайт-специфический интеграционный вектор pSET152 использован для межродовой конъюгации между E. coli и S. pristinaespirali [10]. Эта плазмида не содержит репликативных элементов плазмид Streptomyces и поэтому может сохраняться в реципиентных штаммах исключительно в интегрированной в хромосому форме.

Микробиологическая культура и основные генетические манипуляции. Скошенный агар, посевной материал, среда для ферментации и условия культивирования S. pristinaespiralis описаны ранее [3]. Среда для межродовой конъюгации и среда Лури-Бертани (Luria—Bertani), использованные в работе, также опубликованы ранее [10, 11]. При необходимости бактериальные штаммы инкубировали в присутствие антибиотиков: ампицилина (100мкг/мл), апрамицина (50 мкг/мл) или кана-мицина (50 мкг/мл).

Для экстракции ДНК 0.5 мл замороженной суспензии мицелия инокулировали в 25 мл посевной среды и культивировали в течение 48 ч, как описано ранее [8]. Плазмидную ДНК из E. coli и геномную ДНК из S. pristinaespiralis выделяли по стандартным методикам [10, 11]. Компетентные клетки E. coli подготавливали так, как описано ранее [11]. ДНК-полимеразу Taq, ДНК-лигазу T4 и ферменты рестрикции использовали согласно рекомендациям производителя ("Promega", США).

Конструирование рекомбинантных плазмид.

Шесть 1.5 кДа фрагментов ORF гена ptr амплифи-цировали из 6 рекомбинантов на термоциклере MyCycler thermal cycler ("Bio-Rad", США) с использованием ДНК-полимеразы Taq ("Takara", Китай). Последовательности праймеров: 5'-AAACCATG-GTGAATGACGGCAACGACGACC-3' и 5-CG-GAATTCTGTCAGGCCTTCGCCGGAG-3' - с сайтами рестрикции NcoI и EcoRI лигировали в вектор pMD19-T с помощью ДНК-лигазы T4 ("Promega", США). После этого каждую рекомбинантную плаз-миду (pMD-ptr) переносили в клетки E. coli DH5a.

ДНК-шаффлинг. Шесть 1.5 кДа фрагментов, содержащих гены ptr из соответствующих рекомбинантных плазмид pMD-ptr расщепляли рестрикта-зами NcoI и EcoRI ("Promega", США). Около 0.3 мкг продукта каждого гена ptr смешивали и расщепляли ДНКазой I, затем проводили процедуру шаффлинга по ранее опубликованной методике [12] с небольшими модификациями. Программа бес-праймерной ПЦР была изменена следующим образом: 1) 1 цикл при 95°C в течение 3 мин; 2) 20 циклов денатурации при 94°C в течение 1 мин, отжиг с использованием условий снижения скорости

(decreasing stringency rate) при (60 — n*2)°C в течение 60 с и удлинение цепи при 72°C с использованием условий увеличения скорости (increasing stringency rate) при (60 + n*5) с, где n — число циклов; 3) 30 циклов денатурации при 94°C в течение 60 с, отжиг при 56°C в течение 90 с и удлинение цепи при 72°C в течением 5 мин. Продукт беспрай-мерной ПЦР амплифицировали с использованием праймеров и следующей программы: 1 цикл 3 мин при 95°C с последующими 40 циклами 60 с при 94°C,60 с при 60°C, 90 с при 72°C и 1 цикл при 72°C в течение 10 мин. Во всех процедурах ПЦР использована LA Taq ДНК-полимераза ("Takara", Япония).

Для экспрессии библиотек "шаффлированного" гена ptr проведена амплификация 166-членного промот

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком