БИОХИМИЯ, 2011, том 76, вып. 9, с. 1305 - 1314
УДК 577.155.2
ДНКазная, РНКазная И ФОСФАТАЗНАЯ АКТИВНОСТИ АНТИТЕЛ, ОБРАЗУЮЩИХСЯ ПРИ ИММУНИЗАЦИИ ДНК, ДНКазой I И ДНКазой II
© 2011 г. М.А. Красноруцкий, В.Н. Бунева, Г.А. Невинский*
Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, 630090 Новосибирск, просп. Лаврентьева, 8; факс: (383)333-677, электронная почта: nevinsky@niboch.nsc.ru
Поступила в редакцию 28.01.11 После доработки 15.04.11
Проведено сравнение относительных ДНКазной, РНКазной (эффективности гидролиза рибо- и дезоксири-боолигонуклеотидов (ОН)) и фосфатазной (отщепление 5'-концевого фосфата ОН) каталитических активностей антител (АТ), полученных после иммунизации кроликов ДНК, ДНКазой I и ДНКазой II. Показано, что электрофоретически гомогенные препараты поликлональных АТ от неиммунизированных кроликов не обладают этими активностями. Иммунизация кроликов ДНК, ДНКазой I и ДНКазой II приводит к образованию ^в-абзимов, которые проявляют высокую активность в реакции гидролиза ОН и еще более высокую активность в отщеплении 5'-концевого фосфата ОН. При этом значения Кт для суперскрученной плаз-мидной ДНК и ОН, найденные в реакциях их АТ-зависимого нуклеазного гидролиза и фосфатазного отщепления 5'-концевого фосфата, отличаются на 2—4 порядка. Это свидетельствует о том, что нуклеазная и фосфатазная активности относятся к разным фракциям абзимов в составе поликлональных АТ. Таким образом, впервые получены данные, свидетельствующие о возможности получения при иммунизации животных с помощью ДНК, ДНКазы I и ДНКазы II антител с фосфатазной активностью. Обсуждаются возможные причины наработки АТ с фосфатазной активностью при иммунизации кроликов этими иммуногенами.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: иммунизация кроликов ДНК, ДНКазой I и ДНКазой II; абзимы с РНКазной, ДНКазной и фосфатазной активностями.
Искусственные антитела (АТ) против стабильных аналогов переходных состояний химических реакций с каталитическими функциями (или абзимы) уже достаточно хорошо описаны [1].
Известно, что в крови здоровых доноров могут содержаться поликлональные ауто-АТ к самым различным антигенам [2, 3]. Однако относительное количество ауто-АТ существенно выше в крови людей с самыми различными аутоиммунными заболеваниями (АИЗ) [2, 3], а наличие в крови АТ с различными каталитическими активностями характерно именно для АИЗ [1, 4—8]. Считается, что существуют два основных пути образования природных абзимов. Подобно искусственным абзимам, природные аб-зимы могут нарабатываться непосредственно против антигена, который в определенных сос-
Принятые сокращения: АИЗ — аутоиммунные заболевания; АТ — антитела; пАТ — поликлональные АТ; мБСА — метилированный БСА; р^в — поликлональные ^в; ссДНК — суперскрученная ДНК; VI? — вазоактивный ней-ропептид; ОА — относительная активность; СКВ — системная красная волчанка.
* Адресат для корреспонденции.
тояниях может имитировать переходное состояние [1]. К таким абзимам относят АТ, специфически гидролизующие VI? (астма) [9], тиреогло-булин (аутоиммунный тиреоидит) [10], основной белок миелина (рассеянный склероз) [11] и ряд других белков в случае многих АИЗ [5—8]. Абзимы с нуклеазными активностями могут нарабатываться непосредственно против ДНК и РНК в свободном виде или в их комплексах с различными белками [5—8].
Абзимы могут также иметь антиидиотипи-ческую природу: в этом случае они образуются в соответствии с теорией Эрне [12—14]. Если иди-отипические АТ направлены против активного центра фермента, то соответствующие им вторичные антиидиотипические АТ могут иметь структурные характеристики активного центра исходного фермента и, как следствие, обладать каталитической активностью. Ряд ферментов был использован для получения моноклональ-ных абзимов с ацетилхолинэстеразной [14, 15], карбоксипептидазной [16, 17] и р-лактамазной [18] активностями. Предполагается, что кровь пациентов с СКВ может содержать ДНК-гидро-лизующие АТ против топоизомеразы I [19].
В случае различных АИЗ анти-ДНК- и анти-РНК-антитела с нуклеазными активностями получаются в результате аутоиммунизации комплексами ДНК и РНК с различными белками, включая гистоны, которые появляются в крови в результате апоптоза клеток [20]. В настоящее время описаны ^О и/или ^М, а также гидролизующие ДНК, РНК, белки и полисахариды, выделенные из крови пациентов с различными АИЗ (СКВ, тиреоидит Хашимото, полиартрит, рассеянный склероз), а также лим-фопролиферативными и некоторыми вирусными заболеваниями (вирусный гепатит, ВИЧ-инфекция, клещевой энцефалит [1, 4—8, 21]).
Известно, что канонические ДНКазы гидро-лизуют только ДНК и не проявляют активности в гидролизе РНК, а РНКазы не способны гидро-лизовать ДНК. В отличие от канонических нук-леаз 1яО-, 1яА-, 8]^- и ^М-абзимы из крови больных АИЗ и молока здоровых женщин более эффективно гидролизуют РНК, чем ДНК [4—8, 22—25]. В работе [26] показано, что молока человека гидролизуют рибосомальную РНК. Интересно, что различные мышиные монокло-нальные ^О против В-ДНК различного контекста в 30—100 раз быстрее гидролизовали любые РНК, чем ДНК [27]. Также показано, что иммунизация кроликов с помощью ДНКазы ] ведет к наработке идиотипических АТ1, после иммунизации которыми получаются антиидиотипичес-кие АТ2 с ДНКазной активностью [28]. Однако до последнего времени было непонятно, приводит ли аутоиммуннизация с помощью ДНК (или РНК) только к образованию полифункциональных абзимов, способных гидролизовать как ДНК, так и РНК, или возможно параллельное образование обладающих только ДНКазной либо только РНКазной активностью, либо еще какими-то другими активностями. Также было неясно, могут ли нарабатываться АТ с РНКаз-ной активностью, имеющие антиидиотипичес-кую природу. Для выяснения этого вопроса мы недавно провели иммунизацию кроликов с помощью ДНКазы I, ДНКазы II, РНКазы А и комплексов мБСА с ДНК и РНК и сравнили относительные активности полученных АТ в гидролизе плазмидной ссДНК и различных поли-рибонуклеотидов [29—33]. Было показано, что во всех случаях происходит образование р^О, эффективно гидролизующих как РНК, так и ДНК. Соотношение этих активностей и сродство АТ к ДНК и РНК зависели от использованного антигена, но в целом абзимы, полученные в случае всех указанных антигенов, были на 3—4 порядка более активны в гидролизе РНК, чем ДНК [29—33]. С нашей точки зрения, при различных АИЗ ДНК- и РНК-гидролизующие аб-
зимы являются «коктейлем» АТ непосредственно против ДНК, РНК, а также вторичных АТ против самых разных ферментов, гидролизую-щих нуклеиновые кислоты [8, 34].
Использование в работах [29—33] полимерных субстратов не позволило выяснить, те же самые или различные фракции абзимов, входящих в состав поликлональных АТ, катализируют гидролиз нуклеиновых кислот и проявляют фосфатазную активность.
Цель данной работы — анализ энзимологи-ческих особенностей АТ, полученных при иммунизации кроликов ДНК, ДНКазой I и ДНКазой II, в реакциях гидролиза различных ё(рМ)я, (рМ)я и отщепления от них 5'-концевого фосфата.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Иммунизация кроликов. Здоровые трехмесячные кролики были трижды иммунизированы одним из иммуногенов: комплексом ДНК с мБСА (1,5 мг высокополимерной ДНК (свободной от РНК) из тимуса теленка в смеси с 1,0 мг мБСА), ДНКазой I (0,5 мг), ДНКазой II (0,5 мг) и БСА (1,0 мг) с использованием физиологических растворов (0,85% NaCl, 0,02 М NaH2PO4, pH 7,2) [29—33]. Использовали смеси, состоявшие из 0,5 объема полного адъюванта Фрейнда и 0,5 объема раствора антигена. Смесь перемешивали до образования однородного геля и вводили подкожно и в подушечки лап. Две повторные иммунизации проводили смесью с неполным адъювантом Фрейнда через 21 и затем еще через 7 дней. Анализ результатов иммунизации проводили через два месяца после третьей иммунизации.
Выделение антител из крови кроликов. Элект-рофоретически и иммунологически гомогенные препараты пАТ из крови кроликов получали с помощью модифицированной методики, разработанной ранее для выделения абзимов из крови пациентов с АИЗ; были использованы аффинная хроматография на протеин А-сефарозе, а затем высокоэффективная гель-фильтрация на колонке Superdex 200 HR, как описано в работах [24, 25, 35, 36]. Для защиты от загрязнений фракции АТ пропускали через фильтры Millex filter («Millipore», США; размер пор 0,2 мкм). Затем использовали их для анализа после хранения в нейтральном буфере в течение недели при 4°. Отсутствие IgA и IgM в препаратах IgG было подтверждено с помощью иммуноблоттинга [22, 23, 30—33]. Чистоту АТ анализировали методом Лэммли в 4—15%-ном градиентном ПААГ (0,1%-ный Ds-Na с (или без) 10 мМ дитиотреи-толом). Белки инкубировали в 50 мМ Tris-HCl-
буфере, рН 6,8, содержавшем 2%-ный Ds-Na, 10%-ный глицерин и 0,025%-ный бромфеноло-вый синий, 1 мин при 100° и наносили на гель. После электрофореза белки окрашивали AgNO3 [29—33]. Была показана электрофоретическая гомогенность АТ. В данной работе использовали препараты АТ, все характеристики которых были приведены в работах [29—33].
Определение ДНКазной, РНКазной и фосфа-тазной активностей АТ. При анализе РНКазной и фосфатазной активностей IgG стандартная реакционная смесь (15 мкл) содержала 50 мМ Tris-HCl-буфер, рН 7,5, 81-159 нМ АТ, а также 18-136 мкМ ОН ((pU)9, (pC)10, (рТ)10 или d(pC)10). Реакционные смеси для анализа ДНКазной активности дополнительно содержали 5 мМ MgCl2, 1 мМ ЭДТА, а также 8-60 мкМ d(pT)10 или d(pC)10 в качестве субстратов. Все реакционные смеси в случае каждого отдельного эксперимента содержали одинаковое количество 5'-[32P]ON; необходимую концентрацию используемых субстратов создавали путем добавления в реакционные смеси необходимого количества холодных (pN)„ или d(pN)n. После инкубации смесей в течение 1-3 ч при 37° реакцию останавливали добавлением 5 мкл формамида, содержавшего 0,25% бромфенолового синего, 0,25% ксиленцианола и 20 мМ ЭДТА. Продукты реакции анализировали с помощью электрофореза в ПААГ (89 мМ т-боратный буфер (pH 8,3), 2 мМ ЭДТА и 8 М мочевина). Для анализа фосфатазной активности использовали 20%-ный гель; время электрофореза соответствовало вхождени
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.