БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2009, том 26, № 5, с. 387-393
УДК 577.151.6:577.24
ДОБАВКА ДИГИДРОКВЕРЦЕТИНА В ПИЩУ СТАРЫМ МЫШАМ ПРИВОДИТ К ВОССТАНОВЛЕНИЮ АКТИВНОСТИ МИТОХОНДРИАЛЬНЫХ ФЕРМЕНТОВ СКЕЛЕТНОЙ МУСКУЛАТУРЫ
© 2009 г. Г. Е. Бронников, Т. П. Кулагина, А. В. Ариповский*
Институт биофизики клетки РАН, 142290, Пущино, Московская обл.; факс: (4967)330509; электронная почта: gennady_bronnikov@rambler.ru *ФГУН ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии, 142279, Оболенск, Московская обл.
Поступила в редакцию 12.11.2008 г.
После доработки 20.02.2009 г.
Исследовано влияние эффективного антиоксиданта флавоноида дигидрокверцетина, добавленного в пищу старым мышам, на активность трех митохондриальных ферментов в скелетной мускулатуре мышей. Показана способность этого соединения восстанавливать активность митохондриальных ферментов у старых мышей. Спектрофотометрическим методом в гомогенатах скелетных мышц смешанного типа определены активности цитратсинтазы (маркер плотности митохондрий в тканях), NADH-коэнзимQ1-оксидоредуктазы (комплекс 1, начало дыхательной цепи митохондрий) и цитохром-с-оксидазы (комплекс 4, завершающий фермент дыхательной цепи). Показано, что активность цитратсинтазы и комплексов 1 и 4 в скелетной мускулатуре мышей существенно снижалась с возрастом. При добавлении дигидрокверцетина в питьевую воду в течение нескольких недель активность цитратсинтазы и комплекса 1 в мышцах старых животных несколько возрастала, а активность комплекса 4 восстанавливалась до уровня фермента в тканях молодых мышей. Максимальная активность цитратсинтазы и комплекса 1 обнаружена в мышцах молодых мышей. В группе, получавшей антиоксидант, активность этих ферментов была промежуточной между активностью в тканях старых и молодых мышей. Чувствительность NADH-коэнзимQ1-оксидоредуктазы к специфическому ингибитору ротенону различалась во всех трех группах мышей. У молодых мышей она составляла ~95%, у старых животных снижалась до 84%, а у получавших дигидрокверцетин старых мышей чувствительность комплекса 1 к ротенону увеличивалась до 98%. Биохимические изменения сопровождались повышением подвижности животных, улучшением состояния шерсти (повышался ее блеск) и уменьшением поверхностных дефектов (язв). Определен также жирнокислотный состав гомогената мышечной ткани у мышей этих трех групп. Обнаружено достоверное снижение доли линолевой и увеличение доли насыщенной стеариновой и полиненасыщенных докозановых кислот, а также повышение количества суммарных жирных кислот в мышцах старых мышей. Не обнаружено статистически значимых различий в жирнокислотном составе в мышцах старых контрольных мышей и старых мышей, получавших дигидрокверцетин.
Ключевые слова: старение, митохондрии, окислительный стресс, антиоксиданты, митохондриаль-ные ферментные комплексы.
Проблема возрастных изменений привлекает к себе все большее внимание, и происходит это не только в связи со значительным старением населения во всех развитых странах, но и в связи с "омоложением" ряда болезней, которые еще недавно считались болезнями пожилого возраста. Гипотеза окислительного стресса как основного повреждающего фактора [1-3] за последние 2025 лет стала доминирующей в объяснении возрастных изменений. Известно, что до 80% активных форм кислорода в организме генерируется в митохондриях. Предполагается, что особенно в тканях с высоким потреблением кислорода митохондрии продуцируют значительное количество пероксидных радикалов. При нарушении функци-
онирования митохондрий количество пероксидных радикалов многократно возрастает [4]. Активные формы кислорода повреждают как белки и липиды, так и митохондриальную ДНК, что наиболее опасно, поскольку блокируется нормальное воспроизведение целого ряда митохондриальных ферментов, часть субъединиц которых кодируется этой ДНК [5]. Накапливающиеся нарушения приводят к дефициту АТР в клетках, ослаблению функции органов, гибели клеток и старению тканей, а далее к развитию таких заболеваний, как саркопения (потеря мышечной массы), болезнь Паркинсона, сахарный диабет второго типа и другие. Полагают, что комплекс 1 ды-
387
4*
хательной цепи является основным поставщиком активных форм кислорода в митохондриях [4].
Принимая во внимание все сказанное, можно говорить об актуальности поиска соединений, способных защищать дыхательную цепь митохондрий от повреждающего действия активных форм кислорода. Дигидрокверцетин (или такси-фолин, ДГК), относится к биологически активным полифенолам из семейства флавоноидов и является сильным антиоксидантом [6, 7]. Его защитное действие показано при ряде патологических состояний [8, 9].
Наряду с определением активности трех мем-браносвязанных митохондриальных ферментов, нами изучен жирнокислотный состав четырехглавой мышцы бедра у молодых и старых мышей, а также у старых мышей, получавших ДГК. Жирнокислотный состав фосфолипидов мембран изменяется с возрастом и является важным фактором регуляции клеточных функций [5]. Растительные флавоноиды не только обладают антиоксидантным действием, но, встраиваясь в клеточную мембрану, они способны модифицировать ее и влиять на активность мембранных ферментов [11, 12].
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
В экспериментах использовали беспородных мышей популяции Kv:SHK из Крюковского центрального питомника в возрасте 23 месяцев к моменту начала приема ДГК. ДГК был выделен из древесины даурской лиственницы на кафедре органической химии Московского педагогического государственного университета и куплен у ООО "Саута".
Старые мыши в течение 6 нед получали ежедневно по 50 мкл водного раствора ДГК (1мг/мл) перорально [6]. Контрольные старые мыши получали по 50 мкл воды. Для сравнения использовали молодых мышей в возрасте 2-3 месяца. При спек-трофотометрическом определении активности митохондриальных ферментов использовали реактивы фирмы "Sigma" (ФРГ). Спектрофотометр Specord M-40 ("Carl Zeiss", ФРГ) был существенно реконструирован с целью получения данных в электронном виде, а также для ~10-кратного повышения его чувствительности и стабильности.
Активность ферментов измеряли с использованием следующих методик [13-15] с незначительными изменениями.
Активность цитратсинтазы регистрировали при 412 нм, отслеживая высвобождение коэнзима А [13]. Об активности комплекса 1 судили по скорости переноса электрона с NADH на ^Q1, которую регистрировали при 340 нм [14]; самопроизвольное окисление NADH прописывали в течение 2.5-3 мин перед добавлением гомогената и далее
вычитали из кинетических данных, полученных в отсутствие или в присутствии ротенона. Активность комплекса 4 определяли при 550 нм по скорости окисления восстановленного цитохрома с [15].
Активность каждого фермента в гомогенате мышечной ткани каждой мыши измеряли не менее 4 раз. Каждая группа мышей состояла из пяти особей. Проверяли также чувствительность комплексов 1 и 4 к специфическим ингибиторам ро-тенону и цианиду, которая составила ~84-98% и 97-99% соответственно. Мышей непосредственно перед опытом забивали методом цервикаль-ной дислокации, брали ~50 мг ткани четырехглавой мышцы и немедленно гомогенизировали на льду в стеклянном гомогенизаторе в 500 мкл среды, содержащей 10 мМ К-фосфатного буфера и смесь ингибиторов протеаз ("Sigma") в диметил-сульфоксиде (20 мкл раствора на 1 мл буфера). После тщательной гомогенизации суспензию дополнительно обрабатывали ультразвуком (4 раза по 20-30 с при половинной мощности УЗДН-1, пробирочный резонатор). Реакцию начинали, добавляя аликвоту гомогената при перемешивании в 1 мл кювету. Для определения активности цитратсинтазы добавляли 5 мкл гомогената, комплекса 1-10 мкл, для комплекса 4 обычно требовалось 4-5-кратное разведение гомогената. Активность NADH-коэнзимQ 1-оксидоредуктазы определяли после преинкубации гомогената при комнатной температуре с 30-50 мкМ NADH в течение 10-12 мин [16]. Концентрацию белка в гомогенате определяли по методу Лоури [17], активность ферментов пересчитывали на 1 мг белка мышечной ткани. Результаты кинетических измерений сохраняли на спектрофотометре в виде *.txt файлов, которые для всех дальнейших расчетов импортировали в KaleidaGraph, версия 4.
У всех групп животных определяли жирнокислотный состав четырехглавой мышцы бедра. Для этого ~50 мг мышечной ткани гомогенизировали в буфере, содержащем спиртовой раствор анти-оксиданта ионола (2,6-ди-трет-4-метилфенол) в конечной концентрации 0.5%. Гомогенаты помещали в стандартные флаконы для работы под давлением и лиофилизировали в вакууме роторной сушилки "САВАНТ". К высушенным образцам добавляли по 300 мкл абсолютного метанола и вновь высушивали при 40-50°С. Метиловые эфиры высших жирных кислот получали метилированием липидов метанольным раствором сухого HCl в присутствии 2,2-диметоксипропана [18] и определяли методом газовой хроматографии на хроматографах HP5890 ("Hewlett-Packard", США) и Хром-5. Рассчитывали абсолютное и относительное содержание индивидуальных жирных кислот методом абсолютной калибровки.
100 г
л
£ Ь о
2 щ
15 и
В о £
80-
60-
Молодые Старые Стар. + ДГК
40-
н ^ лт
О о
^ 2 и м , « л н
тт и М
ое м ф
§ Ц20
м
<
К1 К1 + рот рот, %
Комплекс 1 и его ингибирование ротеноном
500
а к л
е
ю
г
I
400
Молодые Старые Стар. + ДГК
а
0
РЕЗУЛЬТАТЫ
Мы изучали митохондриальные ферменты в гомогенате ткани, а не в изолированных митохондриях. Это обусловлено тем, что, как показано нами ранее [19], в изолированных и дополнительно очищенных центрифугированием в градиенте перколла митохондриях как старых, так и молодых особей ферменты дыхательной цепи имеют практически одинаковые активности. Происходит это, на наш взгляд, потому, что сегодняшние методики выделения и очистки митохондрий ориентированы на получение препаратов с максимальным уровнем сопряженного дыхания. Однако такие препараты митохондрий в действительности могут составлять лишь небольшую долю от всего пула митохондрий клетки или органа. Чувствительность и специфичность использованных нами методов позволила с достаточной точностью определить активность указанных выше ферментов. Показано, что в скелетных мышцах двухлетних
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.