ЖУРНАЛ ОБЩЕЙ БИОЛОГИИ, 2008, том 69, № 5, с. 397-400
УДК. 578.52
ДОКАЗАТЕЛЬСТВО ТРАНСОВАРИАЛЬНОЙ ПЕРЕДАЧИ ВИРУСА ЯДЕРНОГО ПОЛИЭДРОЗА НЕПАРНОГО ШЕЛКОПРЯДА LYMANTRIA DISPAR NUCLEOPOLYHEDROVIRUS (FAM. BACULOVIRIDAE) МЕТОДОМ RAPD-PCR
© 2008 г. В. В. Оберемок
Таврический национальный университет им. В.И. Вернадского 95007 г. Симферополь, пр-т Вернадского, 4, АР Крым, Украина e-mail: genepcr@mail.ru Поступила в редакцию 04.06.07 г.
Методом RAPD-PCR доказана возможность трансовариальной передачи вируса ядерного полиэдроза непарного шелкопряда. С использованием праймера OPA-08 найдены генетические маркеры ДНК вируса, которые рекомендованы для диагностики ядерного полиэдроза непарного шелкопряда, в частности на стадии яйца. Генетические маркеры ДНК вируса позволяют судить о степени обсемененно-сти яиц вирусом ядерного полиэдроза, о генетическом разнообразии вируса, о целесообразности планирования лесозащитных мероприятий.
Ядерные полиэдрозы - наиболее широко распространенная группа вирусных заболеваний насекомых (Гулий, Рыбина, 1988; Злотин, 1989). Чаще всего вспышки численности непарного шелкопряда затухают под влиянием полиэдроза (Воронцов, 1975). Вирус ядерного полиэдроза, поражающий непарного шелкопряда (Lymantria dispar (Lepidoptera: Insecta), способен к длительному существованию в лесной экосистеме как в организме хозяина, так и вне его (Ильиных и др., 1995).
Трансовариальная передача вируса относится к вертикальному пути распространения инфекции, т.е. от родителей к потомству (Тарасевич, 1975). Наряду с горизонтальной передачей инфекции (механическая передача вируса через живые и неживые объекты) трансовариальная передача является основным механизмом распространения вируса и служит одним из факторов возникновения эпизоотий.
Трансовариальная передача вируса представляется более надежной, чем горизонтальная передача, так как вирус не покидает насекомое и защищен его покровами от ультрафиолетовых лучей, высокой температуры, различных детергентов. Поэтому трансовариальная передача является важной адаптацией вируса для выживаемости и расселения и, по-видимому, распространена широко среди вирусов ядерного полиэдроза. Трансовари-ально вирусная инфекция передается от родителей потомству и часто находится в латентном состоянии (Гулий, Рыбина, 1988), пока определенные стрессовые факторы не приведут к вспышке вироза. В такой ситуации важную роль начинает играть роль горизонтальная передача инфекции. Можно ска-
зать, что вертикальная передача вируса является тлеющей искрой вирусной инфекции, превращающейся со временем под действием стрессовых факторов в пламя, а горизонтальная передача вируса -ветром, который его раздувает.
Наряду с работами, показывающими трансова-риальную передачу вирусной инфекции среди насекомых (Тарасевич, 1975; Гулий, Рыбина, 1988; Cooper et al., 2003; Khurad et al., 2004, Chen et al., 2006), есть работы, которые ставят под сомнение такой тип передачи, в том числе и у непарного шелкопряда. Многие из них выполнены 40-50 лет назад, когда было мало известно о вирусах ядерного полиэдроза насекомых, в частности о том, что вирусы ядерного полиэдроза насекомых представлены двумя фенотипами - вирионы, происходящие из полиэдров и почкующийся вирус (Herniou, 2003), один из которых (почкующийся вирус) было тяжело обнаружить из-за его мелких размеров. В исследованиях некоторые ученые ориентировались на поиск полиэдров в яйцах и личинках насекомых (в том числе и непарного шелкопряда) для доказательства трансовариальной передачи вируса и не находили их (Тарасевич, 1975), хотя вирус мог быть представлен и другим фенотипом (почкующийся вирус).
Исходя из сказанного выше, целью работы стало доказательство возможности трансовариальной передачи вируса ядерного полиэдроза непарного шелкопряда методом RAPD-PCR с использованием праймера 0PA-08. Метод RAPD-PCR хорошо зарекомендовал себя для решения разного рода исследовательских задач (Welsh, McClelland, 1990; Williams et al., 1990; Taberner et al., 1997; Gar-
1 2 3 4 5 6
II
* §1
Рис. 1. Электрофореграмма продуктов амплификации ДНК вируса ядерного полиэдроза непарного шелкопряда из разных вирусных препаратов: 1 - из Украины, 2 - из Китая (I); 3 - из России; 4 - из Китая (II), 5 - из Киргизии, 6 - маркер молекулярных весов ДНК от 200 до 1000 пар нуклеотидов с шагом в 100 пар нуклеоти-дов (снизу вверх); 01, 02, 03 - условные зоны продуктов амплификации ДНК вируса ядерного полиэдроза непарного шелкопряда.
8.0 7.2 7.1 6.2 6.1 5.2 5.1 4.2 4.1 3.2 3.1 2.2 2.1 1.2 1.1
01 02 03
Рис. 2. Электрофореграмма продуктов амплификации ДНК вируса ядерного полиэдроза непарного шелкопряда, находящегося внутри и на поверхности яиц: 2.1, 5.1, 6.1 - продукты амплификации ДНК вируса, находящегося на поверхности яиц; 1.1, 3.1, 4.1, 7.1 - отсутствие продуктов амплификации ДНК вируса (ДНК выделяли с поверхности яйца); 1.2, 2.2, 3.2, 4.2, 5.2, 6.2, 7.2 - продукты амплификации ДНК вируса, находящегося внутри яиц; 8 - маркер молекулярных весов ДНК от 100 до 1000 п.н. с шагом в 100 п.н. (снизу вверх); 01, 02, 03 - условные зоны продуктов амплификации ДНК вируса ядерного полиэдроза непарного шелкопряда.
cia, Arruga, 2006; Милованов и др., 2006). С помощью RAPD-PCR-метода в яйце непарного шелкопряда можно обнаружить ДНК вируса любого из двух фенотипов. В литературе нами не было найдено экспериментального подтверждения трансо-вариальной передачи вируса ядерного полиэдроза
непарного шелкопряда, основанного на анализе ДНК вируса методом RAPD-PCR.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Для проведения эксперимента использовали яйца непарного шелкопряда, собранные в Челябинской обл. в 2006 г. Выход гусениц из яиц составлял 23%. Для поиска маркеров вирусной ДНК использовали пять вирусных препаратов на основе вируса ядерного полиэдроза непарного шелкопряда из Киргизии, Китая, России и Украины.
Образцы ДНК вируса выделяли дважды: сначала с поверхности яйца, затем из самого яйца. Это позволило исключить механическое попадание вируса на покровы яиц. Вирусные полиэдры использовали для выделения ДНК из вирусных препаратов. Экстракцию тотальной ДНК проводили согласно стандартной методике (Sambrook et al., 1989) с использованием комплекта реактивов "ДНК-сорб-А" (АмплиСенс, Москва). Для обнаружения ДНК вируса методом RAPD-PCR использовали праймер OPA-08 - GTGACGTAGG (Operon Technologies, USA).
Амплификацию ДНК проводили в реакционной смеси объемом 29 мкл на термоциклере "Тер-цик" (ДНК-Технология, Россия) с использованием реактивов для полимеразной цепной реакции "Ам-плиСенс-200-1" (АмплиСенс, Москва). Амплификацию проводили в течение 45 циклов. Первые 5 циклов шли по схеме: 93°С - 1 мин, 35°С - 1 мин, 72°С - 1 мин. Последующие 40 циклов шли по схеме: 93°С - 0.5 мин, 35°С - 0.5 мин, 72°С - 0.5 мин. Терминальную стадию синтеза проводили при 72°С - 3 мин.
Продукты амплификации разделяли методом электрофореза в 1.8%-ном агарозном геле (Sam-brook et al., 1989) и после окрашивания бромистым этидием анализировали под ультрафиолетом. В качестве маркера использовали DNA-markers M 100 (ИзоГен, Москва) с длиной фрагментов 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 и 1000 пар нуклеотидов.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В ходе RAPD-PCR с использованием праймера 0РА-08 были получены продукты амплификации ДНК вирусов из разных вирусных препаратов (рис. 1). Полученные наборы фрагментов ДНК вируса можно условно разделить на три зоны: 01, 02 и 03, которые присутствуют во всех трех вирусных препаратах (рис. 1). Продукты амплификации обладают хорошей воспроизводимостью, и их можно использовать в качестве маркеров вирусной ДНК. Небольшие различия в продуктах амплификации
ДОКАЗАТЕЛЬСТВО ТРАНСОВАРИАЛЬНОЙ ПЕРЕДАЧИ
399
ДНК вирусов из вирусных препаратов являются следствием разной генетики вирусных частиц, входящих в них.
В ходе RAPD-PCR с использованием праймера OPA-208 были получены продукты амплификации ДНК вирусов, находящихся на поверхности и внутри яиц (рис. 2), содержащие условные зоны 01, 02, 03 (рис. 1). Вирус был обнаружен внутри всех исследованных яиц. Только у трех яиц из семи вирус был найден на поверхности. Причиной низкого выхода гусениц из яиц (23%) может быть как раз наличие вируса ядерного полиэдроза в яйцах непарного шелкопряда.
В качестве маркера вирусной ДНК использовали продукты амплификации ДНК вируса, полученные на вирусных препаратах (рис. 1). Из рис. 2 видно, что отжиг праймера OPA-08 на ДНК непарного шелкопряда не происходил, так как на электрофо-реграмме присутствуют только условные зоны 01, 02, 03, принадлежащие вирусной ДНК (рис. 1).
Вирусные частицы из разных яиц различаются между собой генетически, особенно в районе условной зоны 01 (рис. 2). Это генетическое различие, найденное с использованием праймера 0PA-08 может быть использовано в качестве маркера различных процессов, протекающих в яйце при наличии в нем вируса.
ВЫВОДЫ
Полученные данные доказывают наличие трансовариальной передачи вируса ядерного полиэдроза непарного шелкопряда (рис. 2). Праймер OPA-08 рекомендуется использовать для диагностики ядерного полиэдроза непарного шелкопряда, в частности на стадии яйца.
Обнаружение вирусной инфекции на стадии яйца может стать полезным для суждения о возможности эпизоотии, о степени генетического разнообразия вируса, о целесообразности планирования лесозащитных мероприятий в данном районе исследований.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Воронцов А.И., 1975. Лесная энтомология. М.: Высш. шк. 368 с.
Гулий В В., Рыбина С.Ю., 1988. Вирусные болезни насекомых и их диагностика. Кишинев: Штиинца. 187 с.
Злотин А.З., 1989. Техническая энтомология. Киев: Наук. думка. 183 с.
Ильиных А.В., Бахвалов С.А., Моховиков С.М., 1995. Естественное вирусоносительство у массовых видов лесных насекомых-фитофагов и его связь с жизнеспособностью хозяев // Вопр. вирусологии. № 4. С. 186-187.
Милованов А.Е., Компанийцев А.А., Оберемок В В., Симчук А.П., 2006. Генетические дистанции между номинативными и паратипическими формами Colias crocea Fourc. и C. erate Esp. (Lepidoptera, Pieridae) по данным RAPD-PCR-анализа // Цитология и генетика. Т.
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.