ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2015, том 464, № 6, с. 745-749
БИОХИМИЯ, БИОФИЗИКА, МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 577.12:57.053:57.044
ДОКСОРУБИЦИН ВЫЗЫВАЕТ ВРЕМЕННУЮ АКТИВАЦИЮ ПРОЦЕССА ПОЛИ(АДФ-РИБОЗИЛ)ИРОВАНИЯ БЕЛКОВ В КЛЕТКАХ H9c2 © 2015 г. А. С. Ефремова, С. И. Шрам, академик РАН Н. Ф. Мясоедов
Поступило 25.05.2015 г.
На культурах кардиомиоцитов Н9с2 изучали возможную связь системы поли(АДФ-рибозил)ирова-ния белков с механизмами кардиотоксического действия доксорубицина, лекарственного препарата, широко используемого в химиотерапии злокачественных новообразований. Обработка клеток Н9с2 доксорубицином (1 мкМ) приводила к кратковременному (через 6 ч инкубации) увеличению содержания в ядрах поли(АДФ-рибозил)ированных белков. Обнаруженный факт косвенно указывает на развитие в клетках, обработанных доксорубицином, генотоксического стресса, обусловленного, по всей видимости, стимулирующим действием доксорубицина и его метаболитов на продукцию активных форм кислорода и азота.
DOI: 10.7868/S0869565215300246
Противоопухолевый антибиотик антрацикли-нового ряда доксорубицин (ДР) широко используется в терапии распространенных злокачественных новообразований (рак молочной железы, саркомы мягких тканей, агрессивные лимфомы и др.), а также солидных опухолей различного происхождения у детей [1]. Цитостатическое действие ДР связано с его встраиванием (интеркаляцией) в ДНК, что приводит к ингибированию топоизоме-разы II и нарушению транскрипции и репликации ДНК [1]. В работе [2] был описан многоступенчатый механизм транспорта ДР в ядро клетки. Показано, что ДР путем простой диффузии проникает через плазматическую мембрану внутрь клетки, в цитоплазме связывается с протеасомой и уже в составе такого комплекса транслоцируется в ядро.
Главным ограничивающим фактором применения ДР в противоопухолевой терапии является его высокая кардиотоксичность [1, 3, 4]. Она может быть обусловлена тем, что, накапливаясь в кардимиоцитах, ДР стимулирует развитие окислительного и/или нитрозативного стрессов, вызывает дисфункцию митохондрий, дисрегуляцию обмена Са2+ в клетке и другие нарушения [4, 5]. Однако молекулярные механизмы, посредством которых происходит повреждение и гибель кар-диомиоцитов при действии ДР, до конца не выяснены. Увеличение уровня активных форм кислорода и азота в клетке может приводить к усилению поли(АДФ-рибозил)ирования белков, осуществляемого ферментами поли(АДФ-рибо-
Институт молекулярной генетики Российской Академии наук, Москва E-mail: shram@img.ras.ru
за)-полимеразами (PARP). В зависимости от силы и длительности генотоксического стресса активация PARP может стимулировать как защитные реакции (репарацию ДНК, усиление экспрессии генов провоспалительных факторов), так и гибель клеток по пути апоптоза или некроза [6, 7].
Наиболее изученным представителем семейства PARP является PARP-1, ядерный белок, который участвует в репарации ДНК и регуляции ее матричной активности [6, 7]. Активность PARP-1 в клетке определяется уровнем повреждения ДНК: чем он выше, тем выше активность PARP-1. Это обусловлено тем, что при взаимодействии этого белка с участками, содержащими разрывы ДНК, его активность многократно возрастает [6, 7]. Данные об активности PARP-1 при действии ДР на клетки немногочисленны и весьма противоречивы. В работах [8, 9] было продемонстрировано увеличение активности PARP-1 после обработки ДР эмбриональных фибробластов мыши MEF и опухолевых клеток печени человека HepG2. В других исследованиях, наоборот, показано подавление ДР активности PARP-1 [10, 11]. Однако в литературе отсутствуют сведения о влиянии ДР на активность PARP-1 в кардиомиоцитах. Целью настоящей работы было изучение временной динамики накопления ДР и уровня поли(АДФ-ри-бозы) (PAR) в кардиомиоцитах Н9с2.
Клетки Н9с2 (кардиомиобласты эмбриона крысы; ATCC, CRL-1446) были получены от "LGC Standarts" (Великобритания). Эту линию клеток успешно используют для моделирования кардио-миопатий различной природы, в том числе и индуцированных ДР [12, 13]. Во всех экспериментах культуры клеток Н9с2 сначала растили при стан-
дартных условиях (среда ДМЕМ, обогащенная 10% эмбриональной сыворотки теленка), а после достижения высокой степени конфлюентности — культивировали 48 ч в среде, содержащей 0.5% сыворотки. Полученные таким образом культуры покоящихся клеток Н9с2 по ряду признаков близки к кардиомиоцитам [13]. Для исследования накопления ДР клетки высевали на чашки Петри диаметром 35 мм со стеклянными вставками ("MatTek", США). После перевода клеток в покоящееся состояние их инкубировали в присутствии 1 мкМ ДР ("Teva", Нидерланды) в течение 0.5, 1, 3, 6 и 24 ч. Для контрастирования ядер использовали флуоресцентный краситель Hoechst 33258 ("Sigma", США). Содержание и распределение ДР и Hoechst 33258 в клетках анализировали с помощью конфокальной микроскопии.
Уровень PAR в клетках определяли через 1, 3, 6 и 24 ч после внесения в культуры ДР (1 мкМ). Образцы клеток фиксировали охлажденным на льду метанолом и проводили иммунофлуоресцентный анализ с применением первичных антител мыши к PAR (10Н; "Santa Cruz Biotechnology", США) и вторичных антител, конъюгированных с Alexa-488 ("Invitrogen", США), как было описано ранее [14]. Ингибитор PARP-1 (PJ34, 2 мкМ) добавляли в сестринские культуры за 2 ч до внесения ДР. Ядра окрашивали йодидом пропидия (PI). Флуоресцентные изображения получали на конфокальном микроскопе LSM 510 META ("Carl Zeiss", Германия) с использованием объектива Plan-Neofluar (х40/1.3) в режиме масляной иммерсии. Флуоресценцию Hoechst 33258, ДР, Alexa-488 и PI анализировали при следующих длинах волн возбуждения/испускания: 405/(420-490), 488/(560-615), 488/(505-530) и 543/(560-615) нм соответственно.
Для статистического анализа и графического представления полученных данных использовали программу SigmaPlot 11.0 ("SysStat Software", США).
Для моделирования кардиотоксического действия ДР на клетках Н9с2 мы использовали наиболее распространенную в литературе концентрацию ДР - 1 мкМ (например, см. [13]). Нами была исследована кинетика накопления ДР как во всей клетке, так и отдельно в ядре (рис. 1). Показано, что характерная для ДР флуоресценция обнаруживается в клетке уже через 0.5 ч после его внесения в среду культивирования, а через 24 ч ее интенсивность достигала значений, близких к максимальным. Расчетные значения максимальной флуоресценции ДР во всей клетке и ядре оказались равными 2.39 ± 0.10 и 1.33 ± 0.05 относительных ед. соответственно, а времена полунасыщения всей клетки и ядра ДР - 5.92 ± 0.48 и 4.29 ± ± 0.34 ч (значения параметров определены методом нелинейной регрессии и представлены в ви-
де: X ± SE, рис. 1б). При коротких временах инкубации (0.5—3 ч) содержание ДР в ядрах было значительно выше, чем в цитоплазме (определяли по разности флуоресценции ДР во всей клетке и в ядре), однако при более длительной инкубации (с 6 до 24 ч) доля ДР в цитоплазме резко возрастала. Следует также отметить, что распределение ДР в цитоплазме на этих сроках инкубации является неоднородным, на снимках четко видны крупные ДР-содержащие гранулы (рис. 1а).
Методом иммунофлуоресцентного окрашивания мы показали, что базальный уровень PAR в клетках Н9с2 относительно невысокий (рис. 2а), он в 10—15 раз ниже уровня PAR, который достигается при активации PARP, вызываемой 10-минутной инкубацией клеток в среде с 1 мМ Н2О2 (данные не представлены). При обработке клеток ДР (1 мкМ) достоверное увеличение содержания PAR наблюдали только через 6 ч, причем возрастание уровня PAR происходило как в ядрах, так и в цитоплазме клеток (рис. 2а). Инкубация клеток H9c2 в присутствии ингибитора PARP (PJ34, 2мкМ) приводила к снижению как базального, так и стимулированного ДР уровня PAR. При этом остаточная иммунореактивность PAR существенно не превышала неспецифический уровень флуоресценции в клетках.
Полученные нами данные указывают на то, что обработка клеток Н9с2 ДР приводит к временной активации процесса поли(АДФ-рибо-зил)ирования белков. Содержание PAR увеличивается через 6 ч инкубации клеток Н9с2 с ДР, когда степень насыщения клеток ДР достигает половины максимально возможной. Это также совпадает с сильным накоплением ДР в цитоплазме. Такая картина наблюдается вследствие того, что ДР обладает более высоким сродством к ядерной ДНК, чем к другим структурам клетки. Однако после насыщения ядер ДР начинает накапливаться в цитоплазме, вероятнее всего, в митохондриях, о чем свидетельствует появление ДР-содержащих гранулярных структур.
Увеличение содержания PAR может быть прямым следствием окислительного/нитрозативно-го стрессов, вызванных накоплением ДР в митохондриях [4], его превращением в восстановленные и окисленные формы семихинонов и увеличением экспрессии индуцибельной NO-синтазы [5]. Все эти процессы могут приводить к накоплению в клетке активных форм кислорода и азота, обладающих генотоксическим действием. Наблюдаемое через 24 ч возвращение содержания PAR к исходному уровню может быть связано как с активацией в клетке систем, нейтрализующих активные формы кислорода и азота, так и со смещением баланса между скоростями образования и деградации PAR в сторону последней.
(а)
ДР Hoechst
Рис. 1. Динамика накопления доксорубицина (ДР) в клетках Н9с2. (а) — распределение ДР в клетках Н9с2 через 1, 3, 6 и 24 ч после внесения ДР (1 мкМ). Ядра окрашены красителем Hoechst 33258. Масштаб — 20 мкм. (б) — флуоресценция ДР (X ± SE) во всей клетке (белые кружки) и в ядре (чёрные кружки). Кривые соответствуют расчетным значениям, полученным путем аппроксимации экспериментальных значений функциейf(t) = a(1 — exp(—bt)). Статистический анализ выявил высокую степень корреляции между флуоресценцией ДР (во всей клетке или в ядре) и временем инкубации в рамках выбранной модели: значения коэффициентов корреляции (r) для двух рассматриваемых случаев равнялись 0.991 (p < 0.0001, критерий t) и 0.990 (p < 0.0001, критерий t) соответственно.
m
Р
(а)
чо
о
я
PAR
Pl
• • ¡с ■ • . ♦ • • • • \ • . %
% 9 # $
%
■ * • - • • * i
ф • % с?
т • • • % % 1_1
PAR, отн. ед. 200 г
150
(б)
100
5
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.