ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 579.81
ДОМИНАНТНЫЕ ФИЛОТИПЫ В КЛОНОВЫХ БИБЛИОТЕКАХ ГЕНОВ 16S рРНК ИЗ БАКТЕРИАЛЬНЫХ МАТОВ ГИДРОТЕРМАЛЬНЫХ ИСТОЧНИКОВ КАЛЬДЕРЫ ВУЛКАНА УЗОН, КАМЧАТКА © 2013 г. В. Н. Акимов*, **, 1, О. А. Подосокорская**, М. Г. Шляпников*, В. Ф. Гальченко**, 1
*Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина Российской академии наук,
Пущино, Московская обл.
**Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского Российской академии наук, Москва
Поступила в редакцию 10.07.2012 г.
Методом клоновых библиотек проведен in situ анализ генов 16S рРНК бактериальных матов из 5 гидротермальных источников с температурой излива 36—58°C кальдеры вулкана Узон, Камчатка. В составе 8 клоновых библиотек обнаружено 18 доминантных филотипов, представленных в количестве более 4—5%. Филотип, представляющий зеленую серную бактерию Chlorobaculum sp., был среди доминантных филотипов в большинстве клоновых библиотек. Кроме того, доминантными были филотипы, представляющие зеленые несерные бактерии родов Chloroflexus и Roseiflexus, и пурпурные несерные бактерии родов Rhodoblastus, Rhodopseudomonas и Rhodoferax. Цианобактерии были представлены всего одним доминантным филотипом и только в одном из изученных источников. Среди нефототрофных бактерий доминантными филотипами были представители Sulfurihydro-genibium sp., Geothrix sp., Acidobacterium sp., Meiothermus sp., Thiomonas sp., Thiofaba sp., Spirochaeta sp. Три филотипа до рода идентифицировать не удалось. Большинство родов фототрофных и нефототрофных организмов, филотипы которых обнаружены в гидротермах Узона, ранее выявлялись в гидротермах вулканически активных регионов Америки, Азии и Европы. Полученные данные позволяют предполагать, что в гидротермах кальдеры вулкана Узон преобладают бактериальные маты, осуществляющие анаэробный тип фотосинтеза.
Ключевые слова: кальдера вулкана Узон, гидротермальные источники, бактериальные маты, клоно-вая библиотека, 168 рРНК.
DOI: 10.7868/S0026365613060025
Бактериальные маты, в составе которых доминирующими организмами являются фотосинтези-рующие микроорганизмы (например, цианобактерии в цианобактериальных матах) повсеместно распространены в наземных гидротермах с температурой ниже 72—73°C и наиболее интенсивно изучаются в вулканически активных регионах Северной Америки, Азии и Европы [1—3]. Маты отличаются составом фотосинтезирующих и нефо-тосинтезирующих организмов в зависимости от различных физико-химических факторов, что проявляется также в цвете матов. Например, различают темно-зеленые маты (доминирующие организмы — цианобактерии), оранжевые (доминируют бактерии рода Roseiflexus), светло-зеленые и желто-зеленые (могут доминировать анаэробные фотосинтезирующие бактерии, цианобактерии или даже нефотосинтезирующие микроорганизмы). Определение состава доминирующих орга-
1 Авторы для корреспонденции (e-mail: akimov@ibpm. pushchino.ru; valgalch@inmi.host.ru).
низмов в бактериальных матах наземных гидротерм — важная задача в оценке биогеохимического потенциала этих сообществ и выяснении их структурно-функциональной организации. Оценка таксономического разнообразия микробных сообществ с помощью лишь культуральных подходов (ex situ) недостаточна, в последние два десятилетия для этих целей используют также молекулярно-биологические методы (in situ). На сегодняшний день одним из распространенных подходов в изучении таксономического состава микробных сообществ является анализ клоновых библиотек генов 16S рРНК, получаемых на основе ДНК, выделенной из природных образцов [3]. Примером высокой эффективности применения молекулярных методов является цикл работ по изучению цианобактериальных матов двух наземных гидротермальных источников Йеллоустоунского национального парка США [4—6].
Метод клоновых библиотек генов 16S рРНК был использован нами для выявления доминант-
707
5*
Таблица 1. Места отбора проб бактериальных матов в кальдере Узон
Расположение источников Источник, температура в грифоне
Восточное поле, берег ручья у площадки Парящий Сапожок N 54°29.942' Е 160°00.677' Юпитер 46—58°С (по данным термосканирования в течение 2007—2008 гг.)
Восточное поле, площадка Парящий Сапожок N 54°29.976' Е 160°00.679' Фобос 37°С
Северный склон берега озера Хлоридное (между Восточным и Центральным полями) N 54°30.010' Е 160°00.462' Хлоридное 1 36°С
Северный край Оранжевого поля N 54°30.143' Е 160°00. 049' Оранжевое 1 45°С
Верхний участок Северного поля N 54°30.675' Е 160°00.310' Северное 1 40°С
ных филотипов в бактериальных матах пяти гидротермальных источников с температурой излива 36—58°С, расположенных на трех термальных площадках кальдеры Узон, Камчатка. Поскольку в большинстве изученных нами матов цианобак-терии как доминирующие организмы обнаружены не были, в данной работе используется более общий термин — бактериальные маты.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Изученные гидротермальные источники. Для
отбора проб были выбраны 5 небольших источников с температурой воды в грифоне 36—58°С и низкими скоростями излива — не более 1 л/мин, расположенных на термальных площадках "Восточное поле" (3 источника), "Оранжевое поле" (1 источник) и "Северное поле " (1 источник). Для всех источников диаметр водного зеркала вокруг грифона составлял не более 1.0 м, и глубина была не более 0.2 м. Пробы отбирали из матов, формирующихся в воронке источника по периметру водного зеркала, во время экспедиций с 2005 по 2008 годы (табл. 1).
Отбор и хранение проб. Пробы отбирали из матов желтовато-зеленого и светло-зеленого цветов, которые в наибольшей степени соответствовали типам "Оливковый" и "Зеленый" по классификации Горленко и соавт. [7, 8]. Толщина исследованных бактериальных матов составляла не более 5 мм. Из матов вырезали столбики объемом около 1 см3, которые помещали в пластиковые пробирки объемом 2 см3 и заливали этиловым спиртом до конечной концентрации 25— 30%. Фиксированные пробы транспортировали при температуре 10—30°С; в лабораторных условиях образцы хранили при —20°С.
Выделение ДНК. Перед выделением ДНК из природных образцов, фиксированных в этиловом спирте, клетки осаждали центрифугированием и дважды промывали ТЕ-буфером с 50 мМ ЭДТА (10 мМ Трис-На, 50 мМ ЭДТА, рН 8.0). Разрушение клеток проводили путем трех чередующихся циклов замораживания (—70° С) и оттаивания (50°С) и последующим нагреванием суспензии клеток в течение 5 мин при 85°С [9]. ДНК выделяли фенольным методом [10].
Ген 16S рРНК амплифицировали с универсальными эубактериальными праймерами: 27f (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG) и 1492r (5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT); универсальными архейными праймерами: A8f (5'-TCCG-GTTGATCCTGCCGG), A800r (5'-GTTTAC(R)-GCC(R)GGACTAC) и A1041r (5'-GGCCATG-CACC(W)CCTCTC); цианобактериальными праймерами: Cya106F (5'-CGGACGGGTGAGT-AACGCGTGA), Cya359F (5'-GGGGAATTTTC-CCGCAATGGG), Cya781R(a) (5'-GACTACTG-GGGTATCTAATCCCATT), Cya781R(b) (5'-GAC-TACAGGG-GTATCTAATCCCTTT). ПЦР проводили на приборе GeneAmp PCR System 2700 ("Applied Biosystems", США).
Клонирование. Выделенные ПЦР-фрагменты клонировали в векторе pGEM-T ("Promega", США). Скрининг клоновой библиотеки начинали с амплификации клонированных генов 16S рРНК с праймерами T7f (5'-TAATACGACTCAC-TATA) и Sp6r (5'-TATTTAGGTGACACTATAG), которые специфичны соответствующим промо-торным участкам плазмиды, с последующей ре-амплификацией полученной вставки с эубакте-риальными праймерами 27f и 1492r. Далее ПЦР-продукты подвергали рестрикционному анализу с использованием эндонуклеаз HaeIII и HhaI для выявления групп клонов, несущих сходные фраг-
Таблица 2. Таксономическое положение филотипов, обнаруженных в составе 8 клоновых библиотек генов 168 рРНК из бактериальных матов кальдеры Узон в 2005—2008 гг.
Обозначение филотипа в тексте
Номер в Генбанке
Ближайший таксон
Филум/Класс
KF614124 KF614125 KF614126 KF614127
KF614140
KF614128
KF614141
KF614129
Acidobacterium
Sulfurihydrogenibium
Meiothermus
Thiomonas
Thiofaba
Spirochaeta Calditerrivibrio
Относятся к родам фотосинтезирующих организмов
Филотип Узон 1 Филотип Узон 2 Филотип Узон 3 Филотип Узон 4
Филотип Узон 5
Филотип Узон 6
Филотип Узон 7
Chlorobaculum Chloroflexus Roseiflexus Rhodoferax
Rhodoblastus
Rhodopseudomonas
Oscillatoriales
"Chlorobi" "Chloroflexi " "Chloroflexi "
Proteobacteria /Betaproteobacteria Proteobacteria/Alphaproteobacteria Proteobacteria/Alphaproteobacteria "Cyanobacteria"
Не относятся к родам фотосинтезирующих организмов
Филотип Узон 8 Филотип Узон 9 Филотип Узон 10 Филотип Узон 11 Филотип Узон 12
Филотип Узон 13
Филотип Узон 14 Филотип Узон 15
Geothrix
Acidobacterium
Sulfurihydrogenibium
Meiothermus
Thiomonas
Thiofaba
Spirochaeta Calditerrivibrio
"Acidobacteria " "Acidobacteria " "Aquificae "
"Deinococcus-Thermus" Proteobacteria/Betaproteobacteria
Proteobacteria/Gammaproteobacteria
"Spirochaetes" "Deferribacteres"
Не могут быть отнесены к известным родам
Rhodobacteraceae Филотип Узон 16 Rhodobacteraceae Proteobacteria/Alphaproteobacteria
Thiotrichaceae Филотип Узон 17 Thiotrichaceae Proteobacteria/Gammaproteobacteria
Thermotogae Филотип Узон 18 Thermotogae "Thermotogae"
менты ДНК [11]. У представителей, отличающихся по рестрикционному анализу групп клонов, секвенировали фрагменты генов 16S рРНК длиной не менее 1100 нуклеотидов. Клоны гена 16S рРНК объединяли в филотипы на основании рестрикци-онного анализа либо на основании сходства нук-леотидных последовательностей более 98%.
Определение нуклеотидной последовательности генов 16S рРНК проводили на автоматическом секвенаторе CEQ2000 XL ("Beckman Coulter", США) в соответствии с инструкцией производителя. Нуклеотидные последовательности генов 16S рРНК из клоновых библиотек были депонированы в Genbank, номера которых указаны в табл. 2.
Филогенетический анализ. Для нахождения близкородственных организмов нуклеотидные
последовательности сравнивали с последовательностями генов 168 рРНК базы данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank) и рибосомаль-ной базы данных (RDPII — http://rdp.cme.msu.edu). Последовательности генов 168 рРНК выравнива
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.