БИОХИМИЯ, 2014, том 79, вып. 11, с. 1442 - 1451
УДК 577.218
ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ЭКСПРЕССИЯ (ОВЕРЭКСПРЕССИЯ) ГЕНА SOX2 ВЛИЯЕТ НА НЕЙРОДИФФЕРЕНЦИРОВКУ ПОЛИПОТЕНТНЫХ КЛЕТОК-ПРЕДШЕСТВЕННИКОВ ЧЕЛОВЕКА ЛИНИИ NT2/D1*
© 2014 А. Кляйн**, Д. Дракулич, М. Тосич, З. Павкович, М. Швиртлих, М. Стефанович
Institute of Molecular Genetics and Genetic Engineering, University of Belgrade, Vojvode Stepe 444a, PO BOX 23, 11010 Belgrade, Serbia; fax: (+38)111-3975808, Е-mail: andrijanak@imgge.bg.ac.rs
Поступила в редакцию 29.04.14 После доработки 07.07.14
SOX2 является одним из ключевых факторов транскрипции, принимающих участие в поддержании статуса клеток-предшественников нервной системы. Однако его назначение для процесса дифференцировки нервных клеток, включая фазы типоспецифической и окончательной дифференциации, все еще малопонятно. Принимая во внимание все возрастающее количество свидетельств в пользу того, что для формирования нейронального клеточного фенотипа уровень экспрессии гена SOX2 должен строго контролироваться, целью нашего исследования было изучение влияния конститутивной сверхэкспрессии гена SOX2 на результат нейродифференцировки полипотентных клеток линии NT2/D1, индуцированных ретиноевой кислотой (РК). Мы продемонстрировали, что, несмотря на конститутивную сверхэкспрессию SOX2, клетки NT2/D1 были способны достигать завершающих фаз нейродифференцировки с образованием нейронов и клеток нейроглии. Однако при повышенной экспрессии SOX2 в клетках-предшественниках уменьшалось количество зрелых МАР2-позитивных нейронов в зрелой дифференцированной культуре, в то время как изменений в количестве GFAP-позитивных астроцитов не наблюдалось. Тщательный анализ на уровне отдельных клеток показал, что блокирование экспрессии белка SOX2 коррелировало с появлением характерных фено-типических признаков как у нейронов, так и у астроцитов. Примечательно, что в зрелых нейронах фактор SOX2 полностью отсутствовал, тогда как в астроцитах детектировался низкий уровень экспрессии белка SOX2. Тем не менее клетки-предшественники с высоким уровнем экспрессии SOX2 были неспособны дифференцироваться ни по нейронному, ни по глиальному пути. Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что тонкий баланс между недифференцированным состоянием клеток и их нейродифференци-ровкой определяется уровнем экспрессии фактора SOX2. В отличие от нейронов, астроциты могли сохранять способность к экспрессии небольшого количества белка SOX2 даже по окончании процесса глиогене-за. Требуются дальнейшие исследования для ответа на вопрос, есть ли взаимосвязь между уровнем экспрессии SOX2 в GFAP-позитивных астротитах и их способностью к самовосстановлению с их дифференцированным состоянием и/или с характерными фенотипическими признаками глиальных клеток.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: сверхэкспрессия SOX2, NT2/D1, нейрогенез, глиогенез, нейродифференцировка.
Развитие нервной системы находится под управлением каскада событий, протекающих через ряд стадий, регулируемых специфическими генами. Процесс начинается со стволовой полипотентной клетки-предшественника и за-
Принятые сокращения: SOX-2 — фактор транскрипции SOX-2; РК — ретиноевая кислота.
* Первоначально английский вариант рукописи был опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow), Papers in Press, BM14-118, 07.09.2014.
** Адресат для корреспонденции.
канчивается дифференцированным нейроном или клеткой глии и контролируется как на уровне транскрипции, так и на посттранскрипционном уровне. 80X2 является одним из ключевых факторов транскрипции, участвующих в этом процессе [1—5]. Совместно с 0СТ4 (октамер-связывающий транскрипционный фактор 4) и N^N00 (фактор транскрипции, участвующий в самообновлении эмбриональных стволовых клеток) этот белок осуществляет поддержку циклического процесса транскрипции, призванного контролировать самовосстановление и
сохранность полипотентных стволовых клеток [6]. Более того, согласно последним данным, фактор SOX2 играет также важную роль в процессе выбора пути дифференцировки зародышевых пластов. Было установлено, что уровень экспрессии белка SOX2 не регулируется в клетках, выбравших нейроэктодермальный путь развития, и подавлен в клетках, которые будут развиваться по мезодермальному пути [7].
В то время как роль белкового фактора SOX2 в поддержании статуса стволовой клетки была подтверждена разными авторами [6, 8—10], его функционирование в процессе нейродиффе-ренцировки, включающем фазы типоспецифи-ческой и окончательной дифференцировки, все еще малопонятно. Накопленные данные позволяют предположить, что для правильного развития нервной системы уровень белка SOX2 должен находиться под жестким контролем [1—4, 11—14]. Было установлено, что при высоком уровне экспрессии SOX2 подавлялся нейроноге-нез, тогда как глиогенез продолжался [1, 12, 14]. С другой стороны, подавление активности SOX2 приводило к преждевременному прерыванию клеточного цикла и инициации нейронной дифференцировки [1, 4]. С количественной точки зрения уровни SOX2 в гетерозиготе являются достаточными для правильного развития нервной системы [11, 13—15]. Однако если количество SOX2 в клетках-предшественниках снижалось ниже определенного порогового уровня (ниже 20—30% от уровня «дикого» типа, как у мышей линии с гипоморфной мутацией в гене SOX2), то возникали дефекты в пролиферации клеток-предшественников, процессе нейродиф-ференцировки и созревании клеток нервной системы [2, 3, 5, 14, 16]. Есть данные, полученные в иммуноцитохимических исследованиях, которые иллюстрируют существование градиента уровня экспрессии белка SOX2 в коре головного мозга мыши, что свидетельствует о дозоза-висимом воздействии этого белка. В частности, сообщалось, что в неокортикальных клетках в зоне желудочков мозга мыши происходит блокирование экспрессии белка SOX2: когда эти клетки приобретали статус нейронов, они становились иммунонегативными по этому белку [12]. Кроме того изучение предшественников нервных клеток в дорзальной части теленцефа-лона (конечный мозг) грызунов позволило выявить некоторые вариации во внутриклеточной концентрации белка SOX2 между различными клетками [15].
Мультипотентные лучеобразные клетки глии особенно богаты белком SOX2 по сравнению с промежуточными клетками-предшественниками нервной ткани. Когда эти два раз-
личных класса предшественников были подразделены по уровням экспрессии белка SOX2 и культивированы in vitro, то было обнаружено, что они образуют нейросферы, различающиеся по размерам, способности к самообновлению и полипотентности. А именно, нейросферы, происходившие из клеток с высоким уровнем экспрессии SOX2, обладали высоким формирующим потенциалом, скоростью роста, способностью к самообновлению и дифференцировке с образованием нейронов и клеток глии. И, наоборот, нейросферы из клеток с низкой экспрессией SOX2 демонстрировали противоположные свойства и дифференцировались только в нейроны [15].
Во всей совокупности приведенные данные позволяют предположить, что тонкий баланс между стволовыми клетками-предшественниками и дифференцированными клетками нервной ткани, а также между нейронами и глией может зависеть от уровня экспрессии в них белка SOX2. Соответственно, наше внимание было сосредоточено на выяснении того, может ли конститутивная сверхэкспрессия гена SOX2 препятствовать процессу нейродифференцировки и быть связанной с ее конечным результатом. Для ответа на этот вопрос мы изучали индуцированную ретиноевой кислотой (РК) нейродиф-ференцировку полипотентных клеток эмбриональной карциномы человека линии Ntera2/cl.D1 (NT2/D1) и клеток производного от них клона G3, характеризующихся сверхэкспрессией гена SOX2.
Клетки NT2/D1 были сходны со стволовыми клетками ранних эмбрионов по своей морфологии, антигенным маркерам, биохимии, потенциалу развития и генной регуляции [17]. К тому же, клетки NT2/D1 были способны к нейродиф-ференцировке, индуцируемой РК [17] и приводящей к возникновению двух клеточных типов: нейронов и клеток глии [18]. Сходство нейро-дифференцировки клеток NT2/D1 с внутриутробным нейрогенезом у позвоночных дает возможность считать эти клетки адекватной моделью для изучения in vitro генов человека, вызывающих и регулирующих нейродифференци-ровку [17].
В представленной работе мы продемонстрировали, что, несмотря на конститутивную сверхэкспрессию гена SOX2, клетки NT2/D1 были способны достичь финальных фаз нейродиффе-ренцировки, что приводило к образованию нейронов и клеток глии. Однако при сверхэкспрессии SOX2 происходило уменьшение количества зрелых нейронов, но не количества астроцитов в дифференцированной культуре. Приобретение дифференцированными клетками нейронного
или глиального фенотипа коррелировало с уровнем экспрессии в них белка 80X2. С другой стороны, клетки, поддерживающие очень высокий уровень экспрессии 80X2, были неспособны ни к нейроногенезу, ни к глиогенезу.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Культура клеток. Клетки человека линии NT2/D1 (были любезно предоставлены проф. П.В. Андресом, университет Шеффилда, Англия) и клетки клона G3 (происходят от линии NT2/D1, характеризуются сверхэкспрессией гена SOX2) поддерживали в среде Дульбекко (DMEM) с добавлением 10%-ной фетальной сыворотки крупного рогатого скота, 4,5 г/л глюкозы, 2 мМ глутамина и смеси пенициллин/стрептомицин («Invitrogen», США) при 37° в атмосфере 10%-ного CO2, как было описано ранее [17]. Для индукции дифференцировки к клеткам добавляли 10 мкМ транс-ретиноевую кислоту (РК) («Sigma-Aldrich», США). После начала индукции дифференцировки среду с РК меняли на свежую каждые двое суток в течение четырех недель и изолировали нейроны, как описано в работе Плезе с соавт. [19]. По окончании дифференцировки среду разбавляли 1 : 6 и через два дня встряхивали флаконы для удаления клеток с подложки. Свободно плавающие клетки помещали в чашки, дно которых было покрыто мат-ригелем (Matrigel™, «Becton Dickerson», США), и выращивали в среде с добавкой ингибиторов митоза: 1 мкМ цитозинарабинозид, 10 мкМ ури-дин и 10 мкМ 5-фтор-5-дезоксиуридин («Sigma-Aldrich», США). Среду с ингибиторами митоза меняли каждые два дня в течение десяти дней.
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.