МИКРОБИОЛОГИЯ, 2004, том 73, № 2, с. 284-286
КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ
УДК 579.844.91.017.73
ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ СВОЙСТВА СПОРООБРАЗУЮЩИХ СУЛЬФАТВОССТАНАВЛИВАЮЩИХ БАКТЕРИЙ РОДА DESULFOTOMACULUM, ШТАММОВ 435 И 781
© 2004 г. Е. В. Белякова, Е. П. Розанова
Институт микробиологии РАН, Москва Поступила в редакцию 03.06.2003 г.
В 1978 г. нами были описаны свойства двух штаммов термофильных спорообразующих суль-фатвосстанавливающих бактерий (СВБ) - 435 и 781, которые были отнесены к виду Ов8ы1/о1отаси-1ит nigrificans. Основанием послужили результаты изучения ограниченного набора свойств [1]. Среди термофильных представителей этого рода в то время был известен только nigrificans, окисляющий некоторые органические субстраты (но не ацетат и высшие жирные кислоты) до ацетата и СО2 и растущий в литогетеротрофных условиях за счет Н2/СО2 и ацетата [2] (неполное окисление органических соединений, первый метаболический тип).
В связи с новыми данными о видовом составе представителей рода Desulfotomaculum и о разнообразии физиологии этих микроорганизмов, относящихся к разным метаболическим типам -первому и второму (полное окисление органических соединений) [3-6], назрела необходимость уточнения метаболических свойств штаммов 435 и 781.
Целью настоящих исследований являлось установление метаболического типа СВБ штаммов 435 и 781. Основные задачи - выявление возможности окисления органических соединений и уточнение процессов разложения ацетата, лакта-та, бутирата при редукции сульфатов; исследование возможности роста в литоавтотрофных условиях за счет окисления Н2.
Штаммы 435 и 781 выделены из пластовой воды месторождений углеводородов Западной Сибири [1].
Культивирование СВБ осуществляли в пробирках Хангейта при 60°С. В экспериментах использовали среду Видделя (солоноватую - 1) [7], содержащую 1% ЙаС1, восстановители - Ка2Б ■ 9Н20 (500 мг/л) и Ка2Б204 (50 мг/л), микроэлементы [7], органические соединения по 1 г/л (лактат - 1 г/л; капронат, пальмитат - 0.3 г/л); газовая фаза - аргон. Для выявления роста в литоавтотрофных условиях в пробирки с указанной минеральной средой вводили газовую фазу Н2/СО2 (80 : 20% об.). Окисление ацетата, бутирата и образование про-пионата анализировали методом ГЖХ, а выделение метана - методом газовой хроматографии,
как указано ранее [8]. Образование Н2Б определяли спектрофотометрически с использованием К,К-диметил-парафенилендиамина [9].
Исследованные микроорганизмы образовывали сульфид при культивировании в течение 7-12 сут на средах со следующими органическими соединениями: лактат, пируват, малат, фумарат, сукцинат, формиат, капронат, пальмитат, метанол, этанол и бутанол, а также дрожжевой экстракт. Более длительная инкубация (до 30 сут) приводила к сульфидогенезу на средах с пропионатом, валери-атом, этанолом и пропанолом. Накопление Н2Б в культурах происходило в присутствии двух восстановителей - сульфида натрия и дитионита натрия, или только одного сульфида. Процесс суль-фатредукции не был зафиксирован на средах с сульфатом в присутствии цитрата, тартрата, бен-зоата, глицерина, глюкозы, фруктозы, аспараги-на, глутамата, треонина, триптофана, фенилала-нина. Штаммы 435 и 781 разлагали фумарат с образованием Н2Б без накопления ацетата.
Изученные СВБ окисляли ацетат, присутствующий в среде в качестве единственного источника углерода и энергии, и накапливали сероводород, однако процесс протекал чрезвычайно медленно - за 56 сут культивирования (опыты 1 и 4, табл. 1). В культурах штаммов 435 и 781 окисленный ацетат составил соответственно 1.76 и 1.28 ммоль/л. Судя по показателям молярных отношений сульфид/ацетат (табл. 1), можно заключить, что большая часть ацетата, окисленного бактериями штаммов 435 и 781, поступала на дыхательный процесс. Количество клеток не увеличивалось, и численность их не превысила единиц х106 в 1 мл. Возможно, часть клеток за 56 сут культивирования отмирала. Затрудненное окисление ацетата СВБ 2-ого метаболического типа может быть связано с затратой энергии на активацию субстрата [2].
Присутствие в среде дрожжевого экстракта (0.5 г/л) практически не повлияло на процесс разложения ацетата штаммом 435 (табл. 1). Однако дрожжевой экстракт стимулировал разложение ацетата штаммом 781: количество окисленного ацетата в присутствии дрожжевого экстракта возросло до 2.90 ммоль/л. Увеличились также продук-
ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ СВОЙСТВА 285
Таблица 1. Разложение ацетата сульфатвосстанавливающими бактериями штаммов 435 и 781
Штамм № опыта Культивирование, сутки Субстраты Окисленный ацетат, мМ Продукция сульфида, мМ Сульфид/окисленный ацетат Численность клеток в 1 мл
Ацетат, мМ Дрожжевой экстракт, г/л в опытах теоретически* из окисленного ацетата
435 1 56 4.6** - 1.76 1.60 1.76 0.90 3.7 х 106
» 2 56 4.6 0.5 1.85 1.72 1.85 0.92 4.0 х 106
» 3 10 - 0.5 - 1.74 - - н.д.
781 4 56 4.6 - 1.28 1.20 1.28 0.93 5.2 х 106
» 5 56 4.6 0.5 2.9 4.70 2.90 1.62 1.84 х 107
» 6 10 - 0.5 - 1.86 - - н.д.
Примечание. Прочерки - ацетат (или дрожжевой эктракт) отсутствует в исходной среде; н.д. - нет данных.
_ 2- - _ * По уравнению дыхания для Dt. acetoxidans: СН3СОО + S O4 -- 2HC O3 + HS (1) [4].
** Средние результаты из четырех повторностей.
Таблица 2. Разложение лактата сульфатвосстанавливающими бактериями штаммов 435 и 781 (10 сут культивирования)
№ опыта* Субстраты Продукция Ацетат/сульфид
Штамм Лактат, г/л (мМ) Дрожжевой экстракт, г/л ацетат, мМ сульфид, мМ в опытах теоретически**
435 781 1 (К) 2 3 4 5 (К) 6 7 8 2.0 (17.85 мМ) 2.0 (17.85 мМ) 0.5 (4.45 мМ) 0.5 (4.45 мМ) 2.0 (17.85 мМ) 2.0 (17.85 мМ) 0.5 (4.45 мМ) 0.5 (4.45 мМ) 0.5 0.5 0 15.67 2.68 1.63 0 12.8 3.0 1.68 0 5.21 3.72 3.92 0 5.24 4.27 4.86 0 3.01 0.72 0.41 0 2.44 0.61 0.39 2 2 2 2
Примечание. Прочерки - отсутствует в исходной среде. (К) - контроль, хранение в холодильнике при 8°С.
* Средние значения из двух повторностей. 2 ** По уравнению дыхания для Оези^оуШпо: 2СН3СНОНСОО- + 8О4 -► 2СН3СОО- + 2НСО^ + Ш- + Н+ (2) [2].
ция сульфида и численность клеток (опыт 5, табл. 1). По крайней мере, часть сульфида в опыте 5 образовалось при разложении дрожжевого экстракта: теоретически по уравнению дыхания (1) (табл. 1) продукция сульфида за счет окисления ацетата должна составлять 2.90 ммоль, а практически она составила 4.70 ммоль. Дрожжевой экстракт, присутствующий в среде в качестве единственного субстрата (0.5 г/л), также обуславливал сульфидоге-нез исследованных СВБ (табл. 1), ацетат при этом не накапливался. Таким образом, результаты, полученные для штамма 781, свидетельствуют, что для выявления потребления ацетата представителями рода Desulfotomaculum необходимы наблюдения в течение значительного периода времени и добавление в среду легко усвояемого субстрата, разложение которого не приводит к образованию ацетата. Этим субстратом в данном случае явился дрожжевой экстракт.
В процессах роста исследованных СВБ на средах с лактатом наблюдалось образование ацетата (табл. 2). При этом накапливался сульфид и на два порядка увеличилась численность клеток. Для штаммов 435 и 781 наблюдалось уменьшение молярного отношения ацетат/сульфид до величин менее единицы при снижении содержания лактата и в присутствии дрожжевого экстракта (табл. 2). В дыхательном процессе СВБ первого метаболического типа эти отношения теоретически равны двум (уравнение (2), табл. 2). Виддель [2] полагает, что при окислении ряда органических соединений СВБ второго метаболического типа образование ацетил-КоА происходит быстрее, чем его терминальное окисление до СО2 и избыток первого превращается в ацетат. Следовательно, бактерии второй группы могут разлагать ацетил-КоА до СО2 и до ацетата.
286 БЕЛЯКОВА, РОЗАНОВА
Таблица 3. Разложение бутирата сульфатвосстанавливающими бактериями штаммов 435 и 781
Штамм Вариант опыта Культивирование, сутки Бутират, мМ Продукция, мМ Сульфид/окисленный бутират
Субстрат Окисленный бутират, мМ ацетат сульфид в опытах теоретически*
435** 1 10 7.0 3.9 - 6.5 1.66 2.5
781 1 4 7.0 0.6 0.3 1.0 1.50
» 2 10 7.0 4.0 - 6.0 1.66 2.5
Примечание. Прочерки - ацетат отсутствует.
* По уравнению дыхания для СВБ, полностью окисляющих бутират до СО2: 2СН3(СН2)2СОО- + 58 04 -»- 8НС О3 + 5Н8- +
+ Н+ (3) [2]. ** Средние значения из двух повторностей.
Исследованные микроорганизмы полностью окисляли бутират: в культурах штаммов 435 и 781 было окислено соответственно 3.9 и 4.0 ммоль бутирата из исходного количества 7 ммоль и образовалось 6.5 и 6.0 ммоль сульфида. В четырехсуточ-ной культуре штамма 781 был обнаружен ацетат (0.3 ммоль/л), который в данном случае являлся промежуточным продуктом и при дальнейшем культивировании исчезал. При полном разложении бутирата по уравнению (3) (табл. 3) молярное отношение сульфид/окисленный бутират составляет величину 2.5, а в наших экспериментах - 1.66. Более низкие величины обусловлены тем, что часть образующегося ацетил-КоА в растущей культуре потребляется в конструктивных процессах.
Оба штамма сбраживали пируват при содержании его в среде 1 г/л. В культуральной жидкости штамма 435 появились ацетат (9 ммоль/л) и пропионат (0.5 ммоль/л). Сбраживание лактата не было зафиксировано.
Штаммы 435 и 781 образовывали сульфид (H2S соответственно 10.4 и 9.4 ммоль/л) в условиях ли-тоавтотрофного роста за счет Н2/С02. При этом увеличивалась численность клеток от 106 до 108 в 1 мл. В газовой фазе обнаруживались небольшие количества СН4, так называемого мини-метана [10], составившие для штаммов 435 и 781 соответственно 122 и 118 нмолей в пересчете на 100 мл культуральной жидкости.
Результаты исследования позволяют заключить, что СВБ - штаммы 435 и 781 отличаются от Dt. nigrificans по ряду свойств, таких, как способность окислять большой набор органических соединений, включая формиат, ацетат и высшие жирные кислоты; разлагать бутират без накопления ацетата, восстанавливать сульфаты в авто-трофных условиях за счет окисления Н2 с образованием мини-метана. Согласно этим свойствам они близки к представителям видов рода Desulfo-tomaculum 2-ого метаболического типа - Dt. ace-toxidans [3, 10], Dt. sapomandens [4], а среди т
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.