ОНТОГЕНЕЗ, 2004, том 35, № 2, с. 140-148
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЭМБРИОЛОГИЯ
УДК 591.392
ДОРСОВЕНТРАЛЬНЫЕ РАЗЛИЧИЯ МОРФОГЕНЕТИЧЕСКИХ ПОТЕНЦИЙ БЛАСТОДЕРМЫ ВЬЮНА В ОПЫТАХ С ИЗМЕНЕНИЕМ МАССЫ ЭКСПЛАНТИРУЕМЫХ ФРАГМЕНТОВ1
© 2004 г. А. В. Гордеева, И. В. Неклюдова*
Институт биохимии им. АН. Баха РАН 117119 Москва, Ленинский пр-т, д. 33 *Биологический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова
119992 Москва, Ленинские горы Поступила в редакцию 21.10.02 г. Окончательный вариант получен 23.07.03 г.
Изучали влияние двукратного увеличения массы эксплантируемых фрагментов дорсальной и вентральной областей бластодермы вьюна на стадии ранней гаструлы на их способности к дифференци-ровке осевых структур. Дорсовентральные различия сводятся к тому, что дифференцировка сомитов, по данным факторного анализа, коррелирует с усложнением формы только в двойных дорсальных эксплантатах, а хорда в имеющих ее вентральных фрагментах более дифференцирована, чем в дорсальных. Двукратное увеличение массы дорсальных фрагментов бластодермы усиливает их формообразовательные способности и вызывает сдвиг дифференцировки в сторону образования туловищных осевых структур. Увеличение массы вентральных фрагментов бластодермы не влияет на их дифференцировку и формообразование, но нарушает корреляцию этих процессов.
Ключевые слова: дорсовентральная полярность, дифференцировка, эксплантаты, масса закладки, бластодерма, костистые рыбы.
При исследовании дорсовентральных различий морфогенетических потенций бластодермы вьюна в опытах с эксплантацией ее одиночных фрагментов (Неклюдова и др., 1999) оказалось, что на стадии поздней высокой бластулы вентральные фрагменты, в отличие от дорсальных, не проявляют способности к дифференцировке осевых структур. Однако на стадии ранней гаструлы они приобретают такую способность и образуют полный набор осевых структур, отличаясь от дорсальных лишь степенью дифференцировки; различия, таким образом, чисто количественные. На этом основании можно утверждать, что дорсовентральные различия не имеют качественного характера, а могут быть основаны лишь на относительных темпах их реализации (Белоусов, 2000).
Результаты целого ряда исследований показывают, что способность эмбриональных тканей к дифференцировке in vitro прямо пропорциональна массе эксплантата. Так, например, Лопашов (Lopashov, 1935) сращивал 2-10 фрагментов, выделенных из области презумптивной головной мезодермы ранней гаструлы тритона, и обнаружил, что увеличение массы эксплантата расширя-
1 Работа поддержана Российским фондом фундаментальных исследований (проекты < 02-04-49004, 02-04-49717 и 00-04-5502).
ет спектр образуемых им осевых структур. Трин-каус и Дрейк (Trinkaus, Drake, 1956a, b;) обнаружили усиление дифференцировки при попарном сращивании двух изолированных бластодерм Fundulus heteroclitus или увеличении их суммарной массы в небольших перенаселенных культурах (в сравнении с одиночными бластодермами). Мачмор (Muchmore, 1957) сращивал разное число фрагментов, выделенных из области презумптивной мезодермы аксолотля, в нормальном развитии дающей начало сомитам, и тоже продемонстрировал зависимость дифференцировки от массы исходного материала. С увеличением массы увеличивалось число случаев образования четких мышечных структур, которые вместе с тем были и лучше дифференцированы. Это позволило ожидать усиления дифференцировки фрагментов бластодермы вьюна при попарном их сращивании. Но при сравнении двойных и одиночных фрагментов бластодермы вьюна, эксплантиро-ванных на стадии выгиба желточной клетки (ст. 10), результат оказался совершенно иным: в одиночных эксплантатах степень гистологической дифференцировки оказалась выше, хотя двойные фрагменты образовывали более сложные формы (Неклюдова, Манухова, неопубл. данные). В связи с этим цель нашего исследования - изучение дифференцировки двойных дор-
Рис. 1. Зародыш вьюна на стадии образования зародышевого кольца (ст. 11); вид сбоку (а) и с анимального полюса (б). В - вентральная сторона, Д- дорсальная сторона; ( ►) - край бластодермы, (*=-) - внутренняя поверхность бластодермы, (*-) - контур зародышевого кольца. Масштаб: 500 мкм.
сальных и вентральных фрагментов бластодермы вьюна после эксплантации на стадии образования зародышевого кольца (ст. 11, ранняя гаструла). В задачи исследования вошли: а) изучение поведения двойных дорсальных и вентральных фрагментов бластодермы в первые часы инкубации; б) сравнительный анализ формообразовательных способностей двойных дорсальных и вентральных фрагментов суточной инкубации; в) сравнительный анализ гистологической диф-ференцировки этих фрагментов.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
Объектом исследований служил вьюн Misgur-иш fossilis Ь. (н/отр. Те1ео81е1, отр. Сурйш1огтез, сем. СоЪШёае). Зрелые яйцеклетки получали, осеменяли и инкубировали по стандартной методике (Костомарова, 1975). Операции и прижизненные наблюдения производили под бинокулярным стереоскопическим микроскопом мБС-9. Перед операцией с эмбрионов снимали оболочки с помощью двух препаровальных игл.
На стадии образования зародышевого кольца (ст. 11, рис. 1) вырезали дорсальные и вентральные фрагменты по описанной ранее методике (Неклюдова и др., 1999). Из изолированных фрагментов каждого типа формировали "сандвичи" таким образом, чтобы внутренние поверхности были скреплены между собою. Через 30-40 мин двойные фрагменты помещали в культуральную среду, содержащую равные объемы раствора Гольтфретера двойной концентрации и среды 199 с добавлением 2% эмбриональной бычьей сыворотки и гентамицина из расчета 10 мг на 25 мл. Эксплантаты инкубировали при температуре 16.5-18°С в течение суток. По истечении первого часа инкубации проводили прижизненные
наблюдения поведения эксплантатов. Полученные эксплантаты фиксировали в жидкости Буэ-на, окрашивали борным кармином, проводили по стандартной методике до вазелинового масла и фотографировали с помощью фотонасадки к бинокулярному стереоскопическому микроскопу "Wild М-420", Швейцария.
После суточной инкубации фрагменты обеих групп принимали разнообразную форму. Степень ее дифференцировки условно оценивали в баллах по принятой схеме (Неклюдова и др., 1999): шарообразная или близкая к ней - 1, шарообразная с выростами - 2, удлиненная - 3, удлиненная с изгибами или зародышеподобная - 4.
По завершении процедуры оценки формы проводили гистологическую обработку эксплантатов: изготавливали серийные парафиновые срезы толщиной 7 мкм, окрашивали их гематоксилином по Эрлиху и эозином, а затем по принятой схеме (Неклюдова и др., 1999) оценивали степень дифференцировки осевых структур следующим образом.
Нейралъные структуры: полное отсутствие - 1, отдельные группы клеток нейроэктодермы - 2, нейроэктодерма образует пласт - 3, нейроэкто-дерма образует отделы - 4;
хорда: полное отсутствие - 1, полосы поляризованных клеток предхорды - 2, отчетливая диф-ференцировка хорды - 3, хордальная ткань занимает значительную долю от общего объема эксплантата (встречается практически на всех срезах данной серии) - 4;
сомиты: полное отсутствие - 1, кластеры поляризованных клеток пресомитов - 2, отчетливая дифференцировка сомитов - 3, сомиты встречаются практически на всех срезах данной серии - 4.
В эксплантатах обеих групп, имеющих хорду, измеряли ее площадь с помощью компьютерной системы анализа изображений, используя пакет программ "Видеотерминал" (УТ), автор -В.В. Маркелов. Объем хорды вычисляли посредством умножения площади на толщину среза (7 мкм). Чтобы определить количество клеток в составе хордальных зачатков, производили подсчет ядер клеток хорды; анализировали каждый третий срез серии. Средний объем клеток хорды как показатель степени их зрелости вычисляли путем деления объема хорды на число клеточных ядер в ее составе.
Степень гистологической дифференцировки анализировали с использованием пакета программ "8ТАТ18Т1СА", достоверность различий степени дифференцировки фрагментов различных групп определяли с помощью непараметрического критерия Колмогорова-Смирнова для независимых выборок. Для оценки структуры взаимодействия дифференцирующихся тканей использовали метод анализа главных компонент (факторный анализ) в пакетах программ "ЗТАТОТГСА".
Всего проанализировано 77 двойных фрагментов, из них 40 дорсальных и 37 вентральных. Экспериментальные данные по двойным фрагментам обеих групп сравнивали с опубликованными ранее по одиночным фрагментам бластодермы на этой же стадии (Неклюдова и др., 1999).
В других сериях опытов эксплантаты обеих групп фиксировали 2.5%-ным глютаральдегидом
на 0.1М фосфатном буфере (pH 7.2-7.3) через 0.5, 1 и 3 ч после помещения в культивационную среду. Перед фиксацией производили прижизненные наблюдения эксплантатов. Дофиксацию проводили 1%-ным OsO4 на 0.1М фосфатном буфере при комнатной температуре в течение 1 ч, обезвоживали в этаноле возрастающей концентрации и ацетоне, высушивали методом перехода критической точки и после напыления золотом анализировали с помощью сканирующего электронного микроскопа "Hitachi S-405A", Япония.
РЕЗУЛЬТАТЫ
В первые часы инкубации двойные эксплантаты обеих групп, по данным прижизненных и электронно-микроскопических наблюдений, вели себя одинаково: через полчаса они имели вид плоских лепешек, через час - двух полусфер, соединенных перетяжкой, через три часа принимали шарообразную форму (рис. 2). В процессе инкубации изменялось поведение глубоких клеток: в получасовых эксплантатах они имели относительно изодиаметрическую форму и образовывали только лобоподии (рис. 3, а), в часовых же они становились каплевидными и формировали ламелло- и филоподии (рис. 3, б). Форма поверхностных клеток эксплантатов также менялась: в эксплантатах получасовой инкубации их апикальные поверхности выпуклые и покрыты многочисленными складками (рис. 3, в), а через три
Рис. 3. Глубокие (1) и поверхностные (2) клетки фрагментов бластодермы вьюна: вентральный фрагмент через 0.5 ч инкубации (а) и дорсальные фрагменты через 0.5 (в), 1 (б) и 3 ч (г) инкубации.
ПК - поверхностные клетки, ГК - глубокие клетки, Лбп - лобоподии, Флп - ф
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.