МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2013, том 47, № 4, с. 656-666
МОЛЕКУЛЯРНАЯ ^^^^^^^^^^^^^^ БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ
УДК 577.218
ДОЗОЗАВИСИМЫЕ ЭФФЕКТЫ СТЕРОИДНЫХ ГОРМОНОВ НА ЭКСПРЕССИЮ ГЕНОВ Gfi1 и U2afll4 В Т-ЛИМФОЦИТАХ РАЗНОЙ
СТЕПЕНИ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ
© 2013 г. Л. С. Литвинова, И. О. Мазунин*, А. А. Гуцол, Н. А. Сохоневич, О. Г. Хазиахматова, К. А. Кофанова
Инновационный парк, Балтийский федеральный университет им. Иммануила Канта, Калининград, 236016
Поступила в редакцию 29.01.2013 г. Принята к печати 06.03.2013 г.
В процессе дифференцировки Т-клеток памяти важная роль принадлежит альтернативному сплайсингу гена Ptprc, кодирующего трансмембранную тирозиновую протеинфосфатазу CD45. Один из возможных механизмов регуляции альтернативного сплайсинга Ptprc основан на антагонистических эффектах вспомогательного фактора сплайсинга U2AF26 и фактора транскрипции Gfil, вовлеченных в регуляцию антигензависимой активации Т-клеток. Показано, что стероидные гормоны противоположным образом действуют на транскрипцию генов U2afll4 и Gfil в культурах клеток с разной степенью дифференцировки, подвергнутых антигеннезависимой активации. Глюкокортикоидный гормон дексаметазон (Dex) и женский половой гормон эстрадиол (Est) в низких концентрациях активируют экспрессию U2af1l4 в рестимулиро-ванных клетках CD45RO и предположительно индуцируют образование неактивных конечных изоформ рецептора CD45, тогда как в высоких дозах гормоны, напротив, подавляют этот процесс. В условиях антигеннезависимой стимуляции наивных CD45RA+-клеток Dex (10-5—10-7 M) и Est (10-6 и 1о-7 M) способствуют резкой активации экспрессии гена U2af1l4, что, возможно, приводит к образованию "суррогатных клеток памяти". Дозозависимое действие тестостерона (Test) противоположно действию Est и Dex на примированные (CD45RO+) и наивные (CD45RA+) лимфоциты. Изучение роли стероидных гормонов в контроле дифференцировки Т-клеток памяти в условиях антигеннезависимой стимуляции может представлять интерес для расшифровки механизмов, ассоциированных с формированием хронического иммунного и гормонального дисбаланса.
Ключевые слова: стероидные гормоны, дифференцировка Т-клеток, альтернативный сплайсинг, CD45.
DOSE-RESPONSE EFFECT OF STEROID HORMONES ON THE GFI1 AND U2AFIL4 GENE EXPRESSION IN T LYMPHOCYTES AT DIFFERENT STAGES OF DIFFERENTIATION, by L. S. Litvinova, I. O. Mazunin*, A. A. Gutsol, N. A. Sokhonevich, O. G. Khaziakhmatova, K. A. Kofanova (Innovation Park, Baltic Federal University of Immanuel Kant, Kaliningrad, 236000, Russia; *e-mail: IMazunin@ kantiana.ru). Alternative splicing of Ptprc gene is a key event in memory T cell differentiation. This gene encodes transmembrane tyrosine phosphatase CD45. One of potential mechanisms of alternative splicing regulation is based on antagonistic effects of auxiliary splicing factor U2AF26 and transcription factor Gfil. These two proteins regulate antigen-dependent T cell activation. We have shown that steroid hormones have different effects on U2af1l4 and Gfi1 transcription regulation in dissimilar differentiation stage cell culture, subjected to antigen-independent stimulation. Low concentrations of glucocorticoid (Dex) and female sex hormone (Est) can activate expression of U2af1l4 in re-stimulated cells that probably induce terminal receptor CD45 isoforms formation mechanism, whereas high doses of hormones inhibit the process. In the same conditions Dex in a wide range of concentrations (10-5—10-7 M) and Est (10-6 and 10-7 M) activate U2af1l4 gene expression that probably leads to "surrogate memory T cells" formation. Dose dependent testosterone (Test) effect is opposite to Est and Dex effect on priming (CD45RO+) and naive (CD45RA+) lymphocytes. The role of steroid hormones in memory T cell differentiation in antigen-independent stimulation conditions is of great interest for the understanding of chronic hormonal and immune disbalance mechanisms.
Keywords: steroid hormones, T cell differentiation, alternative splicing, CD45. DOI: 10.7868/S0026898413040095
Принятые сокращения: МНК — мононуклеарные клетки; ПЦР — полимеразная цепная реакция; Dex — дексаметазон; Test — тестостерон; Est — Р-эстрадиол; CD45RO — поверхностный рецептор примированных Т-лимфоцитов иммунной памяти; CD45RA — поверхностный рецептор наивных Т-лимфоцитов.
* Эл. почта: IMazunin@kantiana.ru
В изучении иммунной памяти особого внимания заслуживают молекулярно-генетические механизмы дифференцировки наивных Т-лимфо-цитов в Т-клетки иммунной памяти [1]. На поверхности наивных Т-лимфоцитов находится трансмембранная тирозиновая протеинфосфата-за CD45 (общий лейкоцитарный рецептор), которую кодирует ген Ptprc, состоящий из 33 экзонов. Основной маркер Т-клеток памяти — CD45RO — представляет собой вариант CD45RA, который образуется в результате альтернативного сплайсинга, регулируемого многими факторами, в том числе, вспомогательным фактором сплайсинга U2AF26 (U2 small nuclear RNA auxiliary factor 1-like 4, U2af1l4) и фактором транскрипции Gfil (growth factor independent 1). Предполагается, что антагонистические взаимодействия этих факторов могут определять соотношение вариантов рецептора CD45, регулирующего активность Т-кле-ток во время иммунного ответа [1].
Стероидные гормоны — биологически активные вещества, воздействие которых на процессы пролиферации, дифференцировки и гибели клеток иммунной системы интенсивно изучается. Уровень стероидных гормонов в организме подвержен значительным колебаниям, что важно для адаптации к разного рода воздействиям, включая антигенные [2, 3]. Известно, что кортикостерои-ды и андрогены обладают выраженным иммуно-супрессорным действием, тогда как эстрогены могут усиливать иммунные реакции [2—4]. Действие стероидов, как полагают, носит дозозависи-мый характер, что определяет разнонаправлен-ность их эффектов на основные процессы, обеспечивающие гомеостаз иммунокомпетентных клеток.
В представленной работе изучено влияние стероидных гормонов на изменение уровня мРНК генов Gfil и U2af1l4, определяющих соотношение основных вариантов рецепторов CD45 в разных клеточных культурах: мононуклеарных лейкоцитах (МНК), наивных Т-лимфоцитах (CD45RA+) и примированных Т-лимфоцитах памяти (CD45RO+), полученных от здоровых доноров.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
В работе использовали венозную кровь 22 условно здоровых доноров — 16 мужчин и шести женщин в возрасте от 19 до 39 лет. Фракцию МНК выделяли центрифугированием в градиенте плотности Ficoll-Urografin, р = 1.077 г/см3, ("Pharmacia", Швеция). Часть МНК использовали в эксперименте.
Популяцию Т-клеток иммунной памяти (наивных и примированных) получали из выделен-
ных ранее МНК методом иммуномагнитной сепарации (MidiMACS Separator, LS Columns, "Miltenyi Biotec", ФРГ) с использованием моно-клональных антител к CD45RA+ и CD45RO+ с парамагнитными частицами (MicroBeads human, "Miltenyi Biotec") согласно протоколу фирмы-изготовителя. Содержание фракции CD45RA+- и CD45RO+-лимфоцитов в образцах составляло не менее 95%.
Отсутствие примесей моноцитов (CD14+) и В-лимфоцитов (CD19+) в культурах CD45RA+-и CD45RО+-клеток до и после культивирования подтверждали c помощью проточной цитомет-рии с использованием моноклональных антител, конъюгированных с FITC, PE, PE-Cy7 и PerCP ("Abcam", Великобритания и "e-Bio-science", США). Анализ поверхностных маркеров проводили на проточном цитофлуориметре MACS Quant ("Miltenyi Biotec"), согласно протоколам производителей. Использовали клеточные культуры, содержание CD3+CD45RA+CD14-CD19- и CD3+CD45RO+CD14-CD19-клеток в которых составляло в среднем 97.5 ± 2.12% (рис. 1).
МНК, гейтированные по панлейкоцитарному антигену CD45, были представлены следующими субпопуляциями: CD45+CD3+ - 76.21 ± 12.15%; CD3+CD45RA+ - 52.34 ± 13.24%; CD3+CD45RO+ -24.00 ± 7.15%. Кроме того, в популяции МНК здоровых доноров обнаружены клетки CD14+ — 6.42 ± 2.12%, CD19+ - 12.24 ± 3.14%. Остальные клетки были представлены лимфоцитами с фенотипом - CD16+CD56+.
МНК, CD45RA+- и CD45RO+-клетки (1 х х 106 кл/мл) культивировали в 48-луночном планшете в бессывороточной среде Искова ("Sigma"), содержащей 0.5% сывороточного альбумина человека ("Микроген", Россия), 5 х 10-5 M Р-меркап-тоэтанола ("Acros Organics", США) и 30 мкг/мл гентамицина, в присутствии дексаметазона (Dex) ("KRKA", Словения), тестостерона (Test) ("Sigma") и Р-эстрадиола (Est) ("Sigma") в разных концентрациях или без гормонов (контроль) в течение 48 ч при 37°С, во влажной атмосфере, содержащей 5% СO2. В качестве активатора Т-лим-фоцитов использовали реагент T-Cell Activation/Expansion Kit human (Ac/Exp) ("Miltenyi Biotec") - антибиотиновые частицы MACSiBead™ с биотинилированными антителами против CD2+, CD3+, CD28+ человека. Использовали следующие варианты культивирования: 1) ин-тактная проба; 2) проба с добавлением Ac/Exp; 3) пробы с Ac/Exp и Dex (10-7, 10-6, 10-5 М); 4) пробы с Ac/Exp и Test (10-7, 10-6, 10-5 М); 5) пробы с Ac/Exp и Est (10-7, 10-6, 10-5 М).
Количество живых и мертвых клеток в культурах МНК - как CD45RA+-, так и CD45RO+-лим-фоцитов, а также динамику изменения общего ко-
сл
Lfi
00
О U
И
И К о и о м К л
-CD45RO CD3/CD45RO
- 0.85% 98.2%
г
. ' ■ ■
Г ''Twv,'1-
■■ "' ■
■ : - ( 1) !
0% 0.95.%
1 lili i i i i Г i iiil i iii
1еЗ
1е2
С
I
и. н.
нн
л
Н 1е 1
1е0
-
-CD45RO - 98.1% CD45RO/CD19 0%
;
"' V®
Щк.
1.8% CD19 0.1%
1еЗ
1е2
С
I
и. н.
нн
л
Н1е1
1е0
-CD45RO CD45RO/CD14
- 97.4% 0.3%
|¡jp
i_ '■' ]' ^vVfv-
^ 0.6% CD14
0.7%
le—1 leO leí 1е2 1еЗ le-0 leO leí 1е2 1еЗ le-0 leO leí 1е2 1еЗ le-0 1е0 leí 1е2 1еЗ
1000
750
U 500
С/Э С/3
250
VioBlue-A
д
-
- CD45
97.45%
.....
1еЗ
Р1/РЕ-Су5.5-А
е
1е2
С
I
и. н.
нн
л
Н1е1
1е0
CD45RA ■ 1.3%
0.6% _|_■ ■ ■
CD3/CD45RA 96.6%
CD3 1.5%
_|_■ ■ ■'_i_■ ■ ■'_i_■ ■ ■
1еЗ
РЕ-Су7-А
ж
1е2
С
I
и. н.
нн
л
Н 1е 1
1е0
-CD45R/ CD45RA/CD19
- 98.1% 0.1%
-ШЁ&Е '
^ 2.5% CD19
0.3%
1еЗ
РЕ-А
з
1е2
С
I
и. н.
нн
л
Н1е1
1е0
-CD45RA CD45RA/CD14
- 96.4% 0.8%
:
If^llra : ■
i 1.9% CD14
0.9%
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.