УДК 576.32/.36;57.085.23;57.053.2;577.352.465
ДОЗОЗАВИСИМЫЙ ХАРАКТЕР АНТИАПОПТОТИЧЕСКОГО И ТОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ УАБАИНА В ПЕРВИЧНОЙ КУЛЬТУРЕ НЕЙРОНОВ КОРЫ КРЫСЫ
© 2012 г. А. Е. Большаков1, Д. А. Сибаров2*, П. А. Абушик1, И. И. Кривой2, С. М. Антонов1
Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН, 194223, Санкт-Петербург, пр. Тореза, 44; * электронная почта: dsibarov@gmail.com 2Санкт-Петербургский государственный университет, 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб., 7/9 Поступила в редакцию 17.04.2012 г.
Исследовали влияние уабаина в концентрации 0.01—1 нМ на выживаемость нейронов в условиях эксайтотоксического стресса и собственный эффект более высоких концентраций уабаина (10 нМ— 30 мкМ). Выживаемость нейронов оценивали при помощи теста витальной окраски, позволяющего различать живые, апоптотические и некротические клетки, а также по уровню экспрессии белка Вс1-2. Эксайтотоксический стресс вызывали, воздействуя на нейроны агонистами ионотропных рецепторов глутамата (ММБЛ и каината) в насыщающих концентрациях в течение 240 мин. Исследования проводили на первичной культуре нейронов коры головного мозга крыс (7—14 дней в культуре, ВГУ). Воздействие ММБЛ (30 мкМ) вызывало апоптоз в 45 ± 9% (п = 5) нейронов, а каината (30 мкМ) — в 52 ± 5% (п = 5). В условиях эксайтотоксического стресса наблюдался антиапоптотиче-ский эффект сверхмалых концентраций уабаина (0.01—1 нМ), который сопровождался восстановлением экспрессии белка Вс1-2 и снижением количества апоптотических нейронов до контрольного уровня, равного примерно 10% (п = 5). Неспособность уабаина в данном диапазоне концентраций ингибировать насосную функцию №+,К+-АТР-азы (МКЛ) свидетельствует о сигнальной роли МКЛ в нейропротекторном эффекте уабаина. Собственное токсическое действие уабаина проявлялось при более высоких концентрациях (10 нМ—30 мкМ, 240 мин) и выражалось в гибели около 45% нейронов путем некроза, но не апоптоза. Низкий уровень пороговой концентрации токсического действия уабаина (10 нМ) соответствует его способности ингибировать уабаин-чувствительную а3-изоформу МКЛ. Таким образом, выявлен бимодальный эффект уабаина. Антиапоптотическое действие уабаина проявлялось в условиях эксайтотоксического инсульта при концентрации 0.01—1 нМ. Собственное токсическое действие уабаина наблюдалось при более высоких его концентрациях за счет ингибирования насосной функции МКЛ. Обнаруженная гетерогенность чувствительности нейронов к токсическому действию уабаина связана, предположительно, с различиями в экспрессии а1- и а3-изоформ МКЛ пирамидными и вставочными нейронами.
Ключевые слова: №+,К+-АТР-аза, уабаин, апоптоз, кортикальные нейроны, рецепторы глутамата.
Na+,K+-ATP-a3a (NKA) — интегральный мембранный фермент, основная функция которого заключается в поддержании трансмембранных градиентов Na+ и K+ за счет их активного транспорта. Кардиотонические стероиды (КС), в частности уабаин, являются высокоспецифичными ингибиторами NKA. В относительно больших дозах эти лиганды вызывают деполяризацию мембраны и из-за нарушения трансмембранных градиентов Na+ и K+ тормозят работу ряда других важных транспортных механизмов клетки, включая натрий-зависимый захват глутамата [1]. Сходные нарушения функции NKA наблюдаются при ишемии, приводящей к кислородному голоданию нейронов и сопутствующему дефициту выработки АТР. Связанное с этим избыточное на-
копление глутамата в синаптической щели и межклеточном пространстве в результате усиления неквантовой секреции нейромедиатора [2] приводит к гиперактивации ионотропных рецепторов глутамата и нескомпенсированному входу ионов и Са2+ в цитоплазму. Высокая концентрация свободного внутриклеточного Са2+ усиливает секрецию глутамата, формируя положительную обратную связь, что приводит нейроны в состояние эксайтотоксичности. Распространенной моделью для изучения эксайтотоксичности служит первичная культура нейронов коры в условиях действия насыщающих концентраций агони-стов ионотропных рецепторов глутамата М-ме-тил-^-аспартата (ММЭЛ) и каината (КА) [3—5]. Несмотря на различия механизмов эксайтоток-
ДОЗОЗАВИСИМЫЙ ХАРАКТЕР АНТИАПОПТОТИЧЕСКОГО
423
сичности, вызываемой гиперактивацией рецепторов NMDA или AMPA/KA, преимущественным механизмом гибели нейронов в обоих случаях является апоптоз [6].
На культуре нейронов мозжечка крыс было показано, что уже в концентрации 10 нМ уабаин ингибирует NKA. В присутствии 100 нМ и 1 мкМ уабаина активность NKA снижается до 80 и 50% соответственно [7]. При дальнейшем увеличении концентрации КС усиливается и гибель клеток, связанная с чрезмерной деполяризацией клеточной мембраны. Однако в сверхмалых концентрациях КС вызывают совершенно другие эффекты, в частности, могут усиливать активность NKA [8]. В опытах in vivo было показано, что микроинъекция уабаина в стриатум крысы статистически значимо повышает выживаемость нейронов и экспрессию в них антиапоптотического белка Bcl-2 при нейротоксическом действии каината [9]. Аналогичные данные получены in vitro в первичной культуре нейронов коры крысы, в которых при действии токсических концентраций избирательного агониста ионотропных рецепторов глу-тамата NMDA-типа существенно снижается продукция белка Bcl-2 и многократно усиливается гибель нейронов, главным образом в результате апоптоза. При добавлении в среду 0.1 или 1 нМ уа-баина экспрессия Bcl-2 и выживаемость нейронов восстанавливались до контрольных значений [10].
Мы полагаем, что нейропротекторная активность КС, наблюдаемая в области наномолярных концентраций, обусловлена тем, что КС вызывают два независимых эффекта, реализуемых через NKA — ингибируют насосную функцию и включают сигнальную функцию, активирующую внутриклеточные каскады [10—13]. Высокий потенциал КС в качестве средств, препятствующих гибели нейронов, заставляет нас подробнее изучить механизмы цитотоксического действия КС, которое проявляется при их высоких концентрациях. Кроме того, широкий диапазон концентраций в которых наблюдаются цитопротекторные свойства уабаина [12, 14, 15], ставит вопрос об определении оптимальной эффективной концентрации КС и, в частности, уабаина.
В настоящей работе изучен механизм действия уабаина в концентрации от 0.01 нМ до 30 мкМ на функциональное состояние нейронов. В качестве маркеров выживаемости использовали тест витальной окраски, позволяющий различать живые, апо-птотические и некротические нейроны [16], а также уровень экспрессии клетками белка Bcl-2.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Исследования проводили на первичной культуре нейронов коры большого мозга крыс, полученной из эмбрионов на 16-й день пренатального развития, т.е. в момент, когда кора почти не содержит глиальных клеток. Крыс усыпляли инга-
ляцией СО2, что соответствует этическим нормам работы с животными при проведении экспериментов и правилам, утвержденным комитетом по этике ИЭФБ РАН. Клетки культивировали в питательной среде на стеклах, предварительно обработанных поли-^-лизином. Эксперименты проводили на 7-14-й день культивирования. Использовали физиологический раствор следующего состава (мМ): ШС1 140, КС1 2.8, СаС12 1, М§С12 1, HEPES 10 (рН 7.2—7.4). Отсутствие глюкозы в растворе, как показано нами ранее [16], не приводило к снижению выживаемости нейронов в течение 5 ч. Для того, чтобы исключить нейропротек-торный эффект ионов магния, блокирующих входящие токи через каналы рецепторов ^МЭА [17], в опытах с ММЭА использовали безмагниевый раствор. Агонисты ионотропных рецепторов глу-тамата ММПА или каинат добавляли в перфузион-ный раствор в конечной концентрации 30 мкМ. ММЭА всегда применяли в сочетании с равным количеством глицина, являющегося коагонистом ММЭА-рецепторов.
Изучение нейронов проводили в контрольных условиях (без добавок), в присутствии агонистов рецепторов глутамата без уабаина и в сочетании с уабаином (в концентрациях 0.01 нМ-1 нМ), а также в присутствии уабаина (в концентрациях от 1 нМ до 30 мкМ) без агонистов рецепторов глута-мата. Количественную оценку гибели нейронов осуществляли при помощи витального теста, заключающегося в последовательном окрашивании нейронов акридиновым оранжевым (0.001%) и бромистым этидием (0.001%), по 1 мин каждым [16]. Такая процедура позволяет разделить клетки на три группы - живые, погибшие в результате некроза и находящиеся в процессе апоптоза. Бромистый этидий - краситель с красной флуоресценцией, окрашивает только некротические клетки с нарушенной мембраной, но не проникает в живые или апоптотические. Акридиновый оранжевый проходит через клеточную мембрану и вызывает зеленую флуоресценцию ядер живых клеток. В случае апоптоза и сопутствующего ему закисления цитозоля флуоресценция смещается в оранжевую область. Для оценки соотношения живых, некротических и апоптотических нейронов делали снимки культуры клеток в красной и зеленой областях спектра. По полученной паре снимков строили двумерную диаграмму, в которой по осям располагали яркости пикселей в красной и зеленой областях. Точки на диаграмме соответствовали отличным от нуля значениям интенсивности флуоресценции. Установка шумовых порогов, отсекающих пиксели со слишком слабым свечением, позволила выделить на диаграмме четыре области: 1) пиксели с красной флуоресценцией (600-800 нм) от некротических клеток; 2) пиксели с зеленым свечением (500-560 нм), соответствующие живым нейронам; 3) пиксели с колокализованным свечением в красной и зеле-
ной областях, т.е. апоптотические клетки; 4) пиксели со свечением ниже шумового порога в обеих областях, исключаемые из рассмотрения. Количество пикселей в каждой из областей было пропорционально общей площади, занимаемой на препарате ядрами живых, апоптотических и некротических нейронов.
Перед витальной окраской или фиксацией стекла с нейронами инкубировали в течение 240 мин в физиологическом растворе (контроль) или в растворах, содержащих агонисты рецепторов глутамата (NMDA или каинат) отдельно или в комбинации с уабаином, либо только уабаин в различных концентрациях. Для иммуноцитохи-мического определения клетки Вс1-2 фиксировали в растворе 4% параформальдегида в фосфатно-солев
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.