МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2008, том 42, № 1, с. 123-130
МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ
УДК 577.21 Ускоренная публикация
ДРОЖЖЕВОЙ ШАПЕРОН Hspl04 РЕГУЛИРУЕТ ЭКСПРЕССИЮ ГЕНОВ НА ПОСТТРАНСКРИПЦИОННОМ УРОВНЕ
© 2008 г. А. А. Рубель1, А. Ф. Сайфитдинова1, А. Г. Лада2, А. А. Иижников2, С. Г. Инге-Вечтомов1, А. П. Галкин1*
1Санкт-Петербургский филиал Института общей генетики Российской академии наук,
Санкт-Петербург, 199034 2Санкт-Петербургский государственный университет, Санкт-Петербург, 199034
Поступила в редакцию 17.08.2007 г. Принята к печати 04.09.2007 г.
Дрожжевой шаперон Hsp104 принято рассматривать как белок, обеспечивающий расщепление неструктурированных белковых конгломератов, образующихся в результате стрессового воздействия, а также и прионных агрегатов на мелкие олигомеры и(или) мономеры. В нашей работе исследовано взаимодействие Hsp104 с гибридными белками PrP-GFP и белком GFP. Белок PrP-GFP образует в дрожжах высокомолекулярные агрегаты, тогда как GFP не способен к агрегации. Мы показали, что Hsp104 регулирует количество белков PrP-GFP и GFP в клетке, причем направленность действия ша-перона зависит от того, под каким промотором находятся кодирующие их гены. Сверхпродукция Hsp104 приводит к увеличению количества белков PrP-GFP и GFP при экспрессии соответствующих последовательностей под контролем промотора CUP1. В случае экспрессии этих же генов под контролем промотора GPD сверхпродукция Hsp104, напротив, приводит к уменьшению количества белков PrP-GFP и GFP в клетке. Действие Hsp104 не связано с изменением количества мРНК исследуемых последовательностей и со способностью белков к агрегации. Таким образом, функции этого шаперо-на не ограничиваются разборкой белковых агрегатов. Полученные данные свидетельствуют о том, что Hsp104 регулирует экспрессию генов на посттранскрипционном уровне.
Ключевые слова: шаперон Hsp104, регуляция экспрессии, дрожжи S. cerevisiae, прион млекопитающих, структура промотора.
YEAST CHAPERONE Hsp104 REGULATES GENE EXPRESSION ON THE POSTTRANSCRIPTIO-NAL LEVEL, by A. A. Rubel1,2, A. F. Sayfitdinova1'2, A. G. Lada2, A. A. Nizhnikov2, S. G. Inge-Vechtomov1'2, A. P. Galkin1, * (1St.-Petersburg Branch of Vavilov Institute General Genetics, Russian Academy of Sciences, St.-Petersburg, 196240 Russia, *e-mail: apgalkin@mail.ru; 2St.-Petersburg State University, St.-Petersburg, 196240 Russia). Yeast chaperon Hsp104 is known as a protein which is able to dissociate aggregates of the heat damaged proteins and prion aggregates into smaller pieces or monomers. In our work the effects of Hsp104 on the PrP-GFP and GFP proteins have been analyzed. The PrP-GFP protein forms the high molecular weight aggregates, whereas GFP is unable to aggregate in yeast cell. We have shown that Hsp104 regulates the amount of PrP-GFP и GFP in yeast cells and direction of chaperone action depends on promoter controlling production of these proteins. The overproduction of Hsp104 increases the amount of PrP-GFP and GFP proteins when the corresponding genes are under control of CUP1 promoter. In contrast, the overproduction of Hsp104 decreases the amount of PrP-GFP and GFP is case of their expression under control of GPD promoter. The effects of Hsp104 are not related with any changes in mRNA content of the genes under investigation and with ability of the proteins to form aggregates. Thus, the functions of this chaperon are not restricted by dissociation of the protein aggregates. Our data show that Hsp104 regulates the gene expression on the posttranscriptional level.
Key words: chaperone Hsp104, expression regulation, yeast S. cerevisiae, mammalian prion, promoter structure.
Исторически шапероны принято относить к группе белков теплового шока, которые продуцируются в ответ на повышение температуры и помогают клетке справиться с последствиями стресса. Вместе с тем, многие шапероны экспрес-
* Эл. почта: apgalkin@mail.ru
сируются при физиологической температуре и необходимы для поддержания жизнеспособности. Дрожжевой шаперон Шр104 не является жизненно важным белком и в норме представлен в клетке в небольшом количестве, однако при стрессе уровень его продукции резко увеличивается [1]. В условиях термического шока жизнеспособность
штаммов с делецией гена HSP104 значительно снижена [2]. В отличие от других шаперонов, Hsp104 не предотвращает аномальной укладки и агрегации белков после стрессового воздействия [3], однако он участвует в разборке индуцированных стрессом агрегатов, способствуя, тем самым, реактивации мономеров [2]. Механизм дезагрегации белковых конгломератов под действием Hsp104 пока не ясен. Данные структурного анализа показали, что Hsp104 функционирует в виде гексамера, каждый мономер которого имеет два сайта связывания с молекулой АТР [4]. Гексамер, в котором хотя бы один мономер имеет нарушения в АТР-связывающих последовательностях, не способен выполнять функцию дезагрегазы [5].
Hsp104 необходим также для стабильного поддержания дрожжевых прионов - белков, способных формировать упорядоченные самовоспроизводящиеся агрегаты. Белки Sup35, Ure2 и Rnq1 могут существовать в прионной изоформе ([PS/+], [URE3] и [P/N+]) в ряду клеточных поколений лишь при определенном уровне продукции Hsp104 [6]. Показано, что Hsp104 за счет энергии АТР фраг-ментирует крупные полимеры [PS/+] на мелкие олигомеры, которые инициируют новые раунды прионного превращения [7]. При делеции гена HSP104 прионные агрегаты не расщепляются и утрачиваются в процессе клеточных делений. Сверхпродукция этого дрожжевого шаперона приводит также к элиминации фактора [PS/+] [8], но не [URE3] [9] и [P/N+] [10]. Следует отметить, что Sup35, Ure2 и Rnq1 относятся к группе белков, обогащенных глутамином и аспарагином (N/Q), что предопределяет их склонность к формированию упорядоченных амилоидных агрегатов, обогащенных ß-слоями [11]. Вопрос о характере взаимодействия Hsp104 с другими амилоидными белками, которые не содержат N/Q-трактов, остается открытым.
В представленной работе мы исследовали влияние этого шаперона на амилоидный белок мыши PrP (Prion Protein), слитый с последовательностью зеленого флуоресцирующего белка GFP (Green Fluorescein Protein). Белок PrP, агрегация которого приводит к возникновению прионных нейроде-генеративных заболеваний млекопитающих, образует амилоидные полимеры, хотя не содержит N/Q-богатых последовательностей [12]. В агрегированной изоформе PrP формирует устойчивый к протеазе фрагмент, включающий последовательность с 90-й по 231-ю аминокислоту, который необходим и достаточен для прионизации [13, 14]. В опытах in vitro показано взаимодействие Hsp104 с PrP [15, 16]. В бесклеточной системе дрожжевой шаперон стимулирует агрегацию PrP, но только в присутствии предсуществующих, частично денатурированных, агрегатов PrP [16].
В нашей работе последовательности, кодирующие белки PrP(90-231)-GFP и GFP, были экспрес-сированы под контролем дрожжевых промоторов GPD и CUP1 на фоне делеции и сверхпродукции Hsp104. Показано, что Hsp104 позитивно регулирует экспрессию последовательностей PrP-GFP и GFP под контролем промотора CUP1, но снижает уровень экспрессии этих же последовательностей под контролем промотора GPD. Наблюдаемые эффекты не связаны со способностью белков к агрегации. При изменении уровня продукции Hsp104 количество мРНК исследуемых последовательностей не изменяется. Таким образом, мы впервые показали, что Hsp104 регулирует дифференциальную экспрессию генов на посттранскрипционном уровне.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Штаммы, среды и условия культивирования.
В работе использовали следующие штаммы дрожжей Saccharomyces cerevisiae: GT113(MATa/MATa ade1-14/ade1-14 his3A/his3A leu2-3, 122/leu2-3, 112 lys2/lys2 ura3-52/ura3-52 trp1-289/trp1-289 SUP35/sup35A::HIS3 [psi] [pin ]) [17]; BY4742 (MATa his3A-1 leu2A-0 lys2A-0 ura3A-0) ("Invitro-gen", США); BY4742(hsp104A) (MATa his3A-1 leu2A-0 lys2A-0 ura3A-0 hsp104::KANr) ("Invitro-gen", США). Для амплификации плазмидной ДНК использовали штамм E. coli DH5a: (supE44 AlacU169 (ty80lacZAM15) hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi-1 relA). При культивирования E. coli использовали жидкую и твердую среду LB и жидкую среду SOB [18]. Дрожжи культивировали при 30°С на твердой и жидкой среде YAPD, а также на синтетических средах, содержащих необходимые витамины, микроэлементы и аминокислоты [19, 20]. Для экспрессии генов под контролем индуци-бельного промотора CUP1 в среды добавляли CuSO4 в концентрации от 3 до 100 мкМ.
Плазмиды. Все плазмиды, использованные в данной работе, содержат дрожжевой и бактериальный участки начала репликации. Плазмиды pLH105 и pRS316CG [21] любезно предоставлены Ю.О. Черновым. Плазмида peDNA3-1-3F4 [22], содержащая ген PrnP мыши, любезно предоставлена Д. Харрисом. Плазмида pRS424-GPD-HSP104-KT получена следующим образом. Промотор GPD из плазмиды pLH105, фланкированный сайтами рестрикции SalI-BamHI, был интегрирован в вектор pFL39, гидролизованный эндонуклеазами рестрикции XhoI-BamHI. Затем в полилинкер, расположенный за промотором GPD, встраивали фрагмент BamHI-SacI (3.2 т.п.н.), содержащий мутант-ную последовательность HSP104-KT-218,620 из плазмиды pFL39-GAL-HSP104-KT [23]. Плазмида содержит последовательность гена HSP104 с двумя заменами аминокислоты Lys на Thr в районах 218-го и 620-го кодонов. Экспрессия последова-
тельности Hsp104-KT-218,620 (в дальнейшем HSP104-KT) оказывает доминантно-негативное воздействие на АТРазную активность нативного белка Hsp104 [24]. Плазмида PCUPi-GFP(URA3) получена путем интеграции фрагмента XhoI-SacI размером 1.2 т.п.н. из плазмиды pRS316CG, несущего последовательность гена GFP под контролем промотора CUP1, в вектор pFL44S [25], гид-ролизованный эндонуклеазами рестрикции XhoI и SacI. Последовательность, кодирующая фрагмент белка PrP мыши с 90-й по 231-ю аминокислоту, амплифицировали с помощью ПЦР c использованием в качестве матрицы плазмиды pcDNA3-1-3F4. Последовательность праймеров приведена ниже
F-primer: 5'-gttcatggatcctatatgtctcaaggagggggtacccat;
R-primer: 5'-gggccgcggttatcagctggatcttctcccgtcgta. Плазмиду PCUP1-PrP-GFP(URA3
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.