МИКРОБИОЛОГИЯ, 201S, том 84, № S, с. 612-61S
КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ
ДРОЖЖЕВЫЕ ГРИБЫ, АССОЦИИРОВАННЫЕ С ВЕТРООПЫЛЯЕМЫМИ РАСТЕНИЯМИ - ВЕДУЩИМИ ПЫЛЬЦЕВЫМИ АЛЛЕРГЕНАМИ В СРЕДНЕЙ ПОЛОСЕ РОССИИ © 2015 г. А. М. Глушакова*, А. В. Качалкин*, Т. М. Желтикова**, И. Ю. Чернов*, ***,1
*Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, факультет почвоведения
**НИИвакцин и сывороток РАМН ***Институт проблем экологии и эволюции им. А.Н. Северцова РАН Поступила в редакцию 28.11.2014 г.
DOI: 10.7868/S0026365615050080
В последние годы исследованию филлосферы и сопряженных с ней надземных растительных субстратов посвящается множество работ. Они носят как разовый, так и мониторинговый характер, и касаются таксономических и экологических особенностей эпифитных и эндофитных дрожжевых сообществ листьев, цветков, плодов (Глушакова, Чернов, 2010; Глушакова и соавт., 2013; Исаева и соавт., 2010; Herrera et al., 2009; Herzberg et al., 2002; Jindamorakot et al., 2008; Lachance et al., 1998; Lachance et al., 1999; Manson etal., 2007; Rosa et al., 1999; Rosa et al., 2007; Rosa etal., 2009; Saluja, Prasad, 2007; Sipiczki, 2010; Wang et al., 2008). Однако при этом дрожжевое население некоторых растительных субстратов изучено крайне слабо. Прежде всего, речь идет о таких надземных растительных субстратах, как древесная кора, а также пыльца ветроопыляемых растений. Ранее было показано, что на коре развиваются типичные эпифитные и эврибионтные ба-зидиомицетовые виды дрожжевых грибов (Golubev, Mojilevskaya, 1982). Однако эти исследования проводились достаточно давно и представляли собой разовые анализы. Кроме того, произошедшие в последние годы изменения в подходе к идентификации дрожжевых микроорганизмов требуют дополнительного изучения этого растительного субстрата.
Важность анализа микробных сообществ, присутствующих на пыльце ветроопыляемых растений, определяется тем, что она содержит аллергены, сенсибилизация к которым у лиц с генетической предрасположенностью к атопии может привести к формированию и манифестации различных аллергических заболеваний (аллергического ринита, атопического дерматита и др.). Ассоциация пыльцевых зерен и дрожжевых грибов, которые сами часто являются аллергенами, может приве-
1 Автор для корреспонденции (e-mail: soilyeast@mail.ru).
сти к развитию полисенсибилизации. Это существенно усложняет течение заболевания. Кроме того, грибы могут играть роль адъювантов, усиливая действие пыльцевых аллергенов (Puc, 2003).
В связи с этим, важно знать особенности таксономической структуры и численности дрожжевых сообществ, ассоциированной с пыльцой ветроопыляемых растений — ведущих пыльцевых аллергенов в средней полосе России, а также сопряженных с пыльцой растительных субстратов, прежде всего, листьев и коры, и оценить их вклад в формирование специфических пыльцевых сообществ.
Исследования проводили в 2012 году. Были проанализированы пыльца и листья следующих ветроопыляемых растений: Betula pendula Roth, Corylusavellana L., Alnusglutinosa L. (Gaertn)., Dac-tylis glomerata L. Phleum pratense L., а также кора Betula pendula, Corylus avellana, Alnus glutinosa. Выбор объектов исследования был обусловлен тем, что они являются ведущими пыльцевыми аллергенами в средней полосе России.
Пыльцу собирали в двух типах местообитаний: в черте города Москвы (Ярославское шоссе) и в лесной зоне (Дубовая роща, Мытищинский район Московской области). Расстояние между деревьями в городе было порядка 10 м друг от друга, а в лесной зоне деревья образовывали сплошные заросли. Ежа и тимофеевка в лесной зоне образовывали сплошные заросли, в городской зоне произрастали на значительном удалении друг от друга, образуя небольшие скопления.
За весь срок наблюдений, было проанализировано 319 образцов. Пыльцу собирали по методике сбора пыльцы для производства аллергенов. "Букеты" веток с сережками/цветами помещали в емкости с водой и ставили в ламинарный шкаф, в стерильные условия. По мере распускания пыльца опадала на стерильную бумагу. Образцы листьев и коры анализировали непосредственно после сбора.
ДРОЖЖЕВЫЕ ГРИБЫ
613
После измельчения растительного материала готовили навески, помещали их в пробирки и заливали стерильной водой так, чтобы получить разведение 1 : 20 для коры и 1 : 50 для листьев. Навески пыльцы помещали в пробирки и заливали стерильной водой для получения разведения 1 : 10. Суспензии обрабатывали на вортексе ("MultiRe-ax, Heidolph", Germany) в течение 15 мин. Образцы высевали в трехкратной повторности на глюкозо-пептонную среду (глюкоза 20 г/л, пептон 10 г/л, дрожжевой экстракт 5 г/л, агар 10 г/л) с добавлением левомицетина (500 мг/л) для предотвращения роста бактерий. Посевы инкубировали при комнатной температуре 5—7 дней. Выросшие колонии дрожжей с помощью бинокулярной лупы разделяли на морфологические типы и подсчитывали число колоний каждого типа. Представителей каждого типа колоний выделяли в чистую культуру. Культуры дрожжей идентифицировали по морфологическим и физиологическим признакам (The Yeasts..., 2011) и с помощью анализа нуклеотидных последовательностей D1/D2 региона 26S (LSU) рДНК.
Выделение ДНК проводили по следующей методике: биомассу (2 захвата петли) 3-4-х сут культуры переносили в 2 мл эпендорфы, добавляли 400 мкл стеклянной дроби (300—500 мкм диаметром) и 500 мкл лизирующего буфера (TrisBase 50 mM, NaCl 250 mM, ЭДТА 50 mM, SDS 0.3%, pH 8). Приготовленную смесь взбалтывали на вортексе на максимальной скорости 15 мин, затем инкубировали 1 час при 65°C, после повторно взбалтывали на вортексе 15 мин и центрифугировали (13400 об./мин) 10 мин, отбирали надосадочную жидкость.
Для амплификации региона рДНК, содержащего D1/D2 домен региона 26S рДНК, использовали праймеры ITS1f (5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAG-TA) и NL4 (5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG) и смеси для ПЦР ScreenMix (ЗАО "Евроген", Москва). Амплификатор использовали по следующей программе: начальная денатурация — 2 мин при 96°C; затем 35 циклов: денатурация — 20 с при 96°C, отжиг праймеров — 50 с при 52°C, синтез ДНК — 1.5 мин при 72°C; конечная достройка 7 мин при 72°С. Очистку ПЦР-продукта проводили с использованием набора BigDye XTermina-tor Purification Kit ("Applied Biosystems", USA). Для секвенирования использовали праймер NL4. Секвенирование ДНК проводили с помощью набора реактивов BigDye Terminator V3.1 Cycle Sequencing Kit ('Applied Biosystems", USA) с последующим анализом продуктов реакции на секвенаторе Applied Biosystems 3130xl Genetic Analyzer (США) в Научно-производственной компании "Синтол" (Москва). Идентификацию по полученным хро-матограммам проводили, используя данные ген-банка NCBI (ncbi.nlm.nih.gov) и базы данных CBS (www.cbs.knaw.nl).
Для каждого образца определяли общую численность дрожжей и относительное обилие каждого вида, для видов дрожжей рассчитывали частоту встречаемости.
Дрожжевые грибы были обнаружены во всех проанализированных растительных образцах. Их численность варьировала в пределах 102—104 КОЕ/г, причем минимальные значения, в среднем 2.8 х х 102 КОЕ/г, были характерны для коры деревьев. Средние значения численности дрожжей на листьях и пыльце составляли около 3.7 х 103 КОЕ/г.
Всего из филлосферы, пыльцы и с коры за весь период исследования было выделено 20 видов дрожжевых грибов (таблица). Наибольшее количество видов было обнаружено на пыльце — 20 видов, чуть меньше на листьях — 14 видов. Меньше всего дрожжевых грибов было выделено с коры березы, ольхи и лещины. Там было встречено только 6 видов дрожжей. В основном, это эпи-фитные и эврибионтные базидиомицетовые и ас-комицетовые виды. На протяжении всего периода исследования доминирующим на всех растительных субстратах был вид Rhodotorula mucilaginosa — один из самых распространенных фитобионтных видов дрожжей, регулярно выделяющийся из различных растительных субстратов, прежде всего, с листьев (Глушакова, Чернов, 2010). Однако он регулярно обнаруживается и в самых различных местообитаниях: в почве, пищевых продуктах, в пыли. Этот вид хорошо адаптирован к условиям низкой активности воды (Глушакова и соавт., 2004; 2015). В группу доминирующих и субдоминирующих видов вошли также Cryptococcus magnus, Cryptococcus victoriae, а также Candida oleophila (на листьях и пыльце). Первые два вида являются обязательными компонентами большинства эпифитных дрожжевых комплексов. Постоянно высокая встречаемость Candida oleophila на пыльце была выявлена нами ранее в мониторинговом многолетнем исследовании дрожжевого населения пыльцевых зерен (Глушакова и соавт., 2013). Этот вид известен как доминант эпифитных дрожжевых сообществ на надземных частях растений. Относительное обилие этого вида наиболее велико на плодах растений и существенно повышается в конце вегетационного периода (Глушакова и соавт., 2007).
Однако наряду с банальными эврибионтными видами на исследованных субстратах встречались также представители патогенных и условно-патогенных аскомицетовых дрожжей из рода Candida. Последние были выделены исключительно из пыльцы в антропогенной (городской) зоне. Таким образом, ведущие носители пыльцевых аллергенов оказываются "переносчиками" потенциально опасной для человека дрожжевой микрофлоры. В целом встречаемость аскомицетовых дрожжевых грибов, не относящихся к группе патогенов и
614 ГЛУШАКОВА и др.
Частота встречаемости видов дрожжевых грибов на листьях, коре и пыльце исследованных растений, %
Вид Пыльца Листья Кора
Candida albicans 20.1 0 0
Candida glabrata 16.6 0 0
Candida maltosa 19 0 0
Candida oleophila 43 27.8 6
Candida parapsilosis 14.5 0 0
Candida pimensis 12.8 0 0
Candida sake 20.7 2.3 0
Candida tropicalis 8.4 1.2 0
Candida zeylanoides 42 4.5 0
Cryptococcus magnus 83.2 66.7 18
Cryptococcus tephrensis 1.7 32.2 14
Cryptococcus victoriae 59.2 57.8 48
Cryptococcus wieringae 1.7 37.8 0
Debaryomyces hansenii 33.5 12.3 0
Metschnikowia pulcherrima 18.4 31.1 4
Meyerozyma guilliermondii 25.7 13.4 0
Ogataea cecidiorum 10.6 0 0
Rhodotorula mucilaginosa 95 95.6 34
Wickerhamomyces anomalus 21.8 5.6 0
Yamadazyma friedrichii 28.5 3.4 0
условных патогенов, была выше
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.