МИКРОБИОЛОГИЯ, 2015, том 84, № 4, с. 449-455
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 575.222.72:579.25:582.282
ДРОЖЖИ ХОМЛОЛТЛЕЬЫ - ГЕНЕТИЧЕСКИМ РОД СОГЛАСНО МЕЖВИДОВОЙ ГИБРИДИЗАЦИИ © 2015 г. Г. И. Наумов
Научно-исследовательский и учебно-методический центр биомедицинских технологий, Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и ароматических растений РАН, Москва Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов, Москва Поступила в редакцию 10.09.2014 г.
Используя индуцированные комплементарные ауксотрофные мутанты и селективный рост прото-трофных гибридов на минимальной среде, показана гибридизация типового штамма Komagataella кыНшапп ВКПМ У-727 с типовыми штаммами К. pastoris ВКПМ У-3262, К. phaffii МЯКЪ У-7556, К. рорыН ^^ УВ-455, К. pseыdopastoris МИБЪ У-27603 и К. ыШ ^^ УВ-407. Полученные результаты позволяют сделать вывод, что род дрожжей Komagataella, установленный ранее филогенетическим анализом, соответствует концепции генетического рода аскомицетных грибов, согласно которой род есть группа скрещивающихся видов, обладающих общей системой типов спаривания. На примере ряда родов дрожжей обсуждается применение концепции генетического рода.
Ключевые слова: дрожжи Komagataella, Pichia pastoris, межвидовая гибридизация, ауксотрофные мутанты, виды-двойники.
DOI: 10.7868/S002636561504014X
Прежде всего отметим интерес молекулярных биологов и биотехнологов к дрожжам рода Koma-gataella Yamada et al. 1995 [1—5]; дрожжи больше известны под названием Pichia pastoris (Guillier-mond) Phaff 1956 [6], а также Zygowillia pastori (Guilliermond) Kudriavzev 1960 [7, 8]. Очевидно большое прикладное значение этих метаноловых дрожжей привело к их тщательной классификации и идентификации [9—11]. Установлено, что в прошлом таксономический вид Komagataella pastoris (Guilliermond) Yamada et al. 1995 [5] является родовым комплексом, по меньшей мере, шести фенотипически сходных видов: K. pastoris, K. pseudopastoris Dlauchi et al. 2003, K. phaffii Kurtz-man 2005, K. populi Kurtzman 2012 [14], K. ulmi Kurtzman 2012 [14] и недавно описанного вида K. kurtzmanii Naumov et al. 2013 [11]. Филогенетическое родство этих видов-двойников было определено на основе сравнительного анализа нуклео-тидных последовательностей домена D1/D2 и ГГ81/ГГ82-участка рДНК, фактора элонгации EF-1а, РНК полимеразы II и митохондриальной SSU рРНК [10, 11, 14]. Первые два вышеприведенных вида имеют европейское происхождение, остальные — северо-американское. Большинство штам-
1 Автор для корреспонденции (e-mail: gnaumov@yahoo.com).
мов Komagataella было изолировано из сокотече-ний деревьев и разлагающейся древесины.
В настоящей работе мы продолжили изучение межвидовой гибридизации дрожжей Komagataella [11] и действительно обнаружили предсказанную общность системы типов спаривания различных видов этого рода, позволяющую им скрещиваться между собой.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Изученные виды рода Komagataella приведены в таблице. Штаммы получены из Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ), Москва и ARS Culture Collection (NRRL), National Center for Agricultural Utilization Research, Peoria, Illinois, USA. В таблице приведены также номера штаммов в коллекции Centraalbu-reau voor Schimmelcultures (CBS), Утрехт, Голландия. Дрожжи выращивали на полной среде YPD, г/л: ба-кто-агар фирмы "Difco" (США) — 20, глюкоза "РЕАХИМ" (СССР) - 20; дрожжевой экстракт "Difco" — 10, пептон "Difco" — 10. Образование зигот индуцировали на ацетатной среде [15], г/л: бакто-агар — 20; CH3COONa — 5; KCl — 10; глюкоза — 10. Прототрофные гибриды отбирали на мини-
Происхождение и характеристики исследованных штаммов рода Komagataella и других реперных дрожжей {Ркайотусея, Ogataea и РгсМа)
Видовая принадлежность Номер штамма в коллекциях Источник и место выделения Регистрационный номер последовательностей в Генбанке
вкпм NRRL CBS D1/D2 MtSSU EF-la
К. kurtzmanii Y-727 Y-63667T 12817 Сокотечение пихты Abies sp., Южная Аризона, США КС715720 КС715723 КС715721
К. pastoris Y-3262 Y-1603T 704 Сокотечение каштана Castanea sp., Франция U75963 EF547704 EF552478
К. phaffii - Y-7556T 2612 Сокотечение дуба Quercus kelloggii, Калифорния, США AF017407 EF547706 EF552480
К. populi - YB-455T 12362 Сокотечение тополя Populm deltoides, Иллинойс, США JN234404 JN234406 JN234408
К. pseudopastoris - Y-27603T 9187 Гниющий ствол ивы Salix alba, Венгрия AF403149 EF547705 EF552479
К. ulmi - YB-407T 12361 Сокотечение вяза Ulmus americana, Иллинойс, США JN234403 JN234405 JN2 34407
Ph. antillensis - Y-12881T 7111 Поврежденный кактус Cephalocereus royenii, Виргинские острова EU011660 EU014771 EU018559
Ph. opuntiae - Y-l1707T 7010 Гниющий кактус Opuntia inermis, Австралия EU011661 EU014772 EU018560
Ph. thermotolerans - Y-11709T 7012 Кактус Lophocereus schottii, Мексика EU011662 EU014773 EU018561
O. glucozyma - YB-2185T 5766 Экскременты насекомых из ели Picea engelmannii, Вайоминг, США U75520 EU018527 EU014736
P. membranifaciens - Y-2026T 107 Неизвестно U75725 EF547677 EF552451
Lfi
О
S
TJ О и S о и о
M
s
s
о а
£ -t.
о Примечание. Т>1/Т>2 — домен Т>1/Т>2 26в рДНК; М1 вви — ген малой субъединицы мигохондриальной рРНК; ЕР-1а — фактор элонгации трансляции. Т — типовой штамм.
1 2 3 4 5 6
Ф ш
Рис. 1. Гибридизация ауксотрофных мутантов видов рода Komagataella согласно прототрофному росту на минимальной среде в местах пересечения родительских штаммов. Отпечатки дрожжей: 1 - К. kurtzmanii ВКПМ У-727 (а^16); 2 - К. pastoris ВКПМ У-3262 (ЫБ2); 3 - К. phaffii У-7556 (1ув3); 4 - К. рориН КИКЬ УВ-455 (аае6); 5 - К. р&еМо-
pastoris У-27603 (ше12); 6 - К. ulmi КЯКЬ УВ-407 (arg8). В скобках приводятся использованные ауксотрофные
мутанты.
мальной среде, г/л: бакто-агар - 20; глюкоза - 20; азотная основа "ВНео" (без аминокислот) - 6.7. Дрожжи культивировали на всех средах при 25°С. У всех типовых культур с помощью УФ-облуче-ния были индуцированы ауксотрофные мутанты при 10%-ной выживаемости клеток. Для каждого штамма было получено около десяти различных ауксотрофных мутантов.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Гаплонтный жизненный цикл дрожжей Koma-gataella значительно упрощает проведение их гибридизации. Гибриды получили массовым скрещиванием гаплоидных клеток, обладающих комплементарными ауксотрофными мутациями на голодной ацетатной среде. Для этого суточные культуры дрожжей переносили "крест-на-крест" с полной среды УРЭ на голодную среду с помощью бархатного репликатора. После суточной экспозиции дрожжи повторно переносили бархатным репликатором на минимальную среду. Рост прототрофных гибридов наблюдали через 2-3 сут в местах пересечения отпечатков. Прежде всего, была проверена способность к скрещиванию у ауксотрофных мутантов каждого из анализируемых штаммов. Комплементарные ауксотрофные мутанты гомоталличных видов К. kurtzmanii, К. pastoris, К. phafii, К. populi и К. ulmi с той или иной частотой образовывали внутриштаммовые гибриды. На пересечении штрихов наблюдали появление от нескольких прототрофных колоний до сплошного роста. Исключением являются ауксотрофные мутанты штамма К. pseudopastoris МЯЯЬ У-27603, которые не скрещивались между собой, вероятно, из-за наличия клеток только одного типа спаривания.
Результаты межвидовой гибридизации приведены на рис. 1. Тестерные дрожжи К. kurtzmanii ВКПМ У-727 скрещивались со всеми остальными видами рода Komagataella. Таким образом, можно
констатировать, что виды этого рода имеют одну и ту же систему типов спаривания.
Для демонстрации высокой межвидовой и межродовой молекулярной дивергенции дрожжей Komagataella на рис. 2 представлено построенное нами филогенетическое древо, охватывающее все известные виды рода Komagataella и ближайшего рода Phaffomyces Y. Yamada et al. 1997. Низкая статистическая поддержка филогенетического родства указанных родов не позволяет считать их сестринскими родами, на это ранее указывал и сам К. Куртцман [10, 17]. Еще меньше прослеживается родство рода Komagataella с гетерогенным родом Ogataea Y. Yamada et al. 1994, представленном на филогенетическом древе (рис. 2) типовым видом O. glucozyma Y. Yamada et al. 1994. Дифференциация видов Komagataella хорошо документирована при использовании пяти молекулярных маркеров [11], когда дрожжи разделились на три кластера, в каждом из которых по два вида: K. pastoris и K. ulmi, K. kurtzmanii и K. phaffii, K. pseudopastoris и K. populi.
Полученные нами экспериментальные данные указывают на то, что род Komagataella, созданный на основе филогенетического анализа [10, 11, 14, 17], отвечает концепции генетического рода аскоми-цетных грибов. Согласно которой виды одного рода обладают общей системой типов спаривания, позволяющей им скрещиваться в любой комбинации [18]. Тем не менее, генетические роды охватывают настоящие биологические виды, имеющие постзиготическую изоляцию — нежизнеспособные продукты мейоза (аскоспоры) гибридов. Спустя 35 лет можно констатировать, что не только дрожжи Saccharomyces [19—22], но и другие ревизированные роды соотвествуют генетической концепции рода: Williopsis Zender 1925, Arthroascus von Arx 1972, Kluyveromyces Kurtzman et al. 2001 (syn. Zygofabospora Kudriavzev 1960 emend G. Naumov 2002), Zygowilliopsis Kudriavzev 1960,
452
НАУМОВ
0.02
67
100
99 г K. kurtzmanii NRRL Y-63667T
100
[í
100
100
ta > &
<3
K. phaffii NRRL Y-7556T K. ulmi NRRL YB-407T
_K. pastoris NRRL Y-1603T
K. populi NRRL YB-455T in I— K. pseudopastoris NRRL Y-27603T
- Ph. thermotolerans NRRL Y-11709T
- Ph. antillensis NRRL Y-1281T - Ph. opuntiae NRRL Y-1170T
100
99
Ogataea glucozyma NRRL YB-2185T
Pichia membranifaciens NRRL Y-2026T
e
c myc
ffo
a Pha
Рис. 2. Молекулярная дифференциация дрожжей рода Komagataella согласно филогенетическому анализу нуклеотид-ных последовательностей домена D1/D2 26S рДНК, фактора элонгации трансляции EF-1a и гена малой субъединицы митохондриальной рРНК. Шкала соответствует 20 нуклеотидным заменам на 1000 нуклеотидных позиций. Древо строи
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.