БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2007, том 24, № 4, с. 292-298
УДК 577.218
ДУПЛИКАЦИЯ ЦЕНТРИОЛЕЙ В КЛЕТКАХ СПЭВ НАЧИНАЕТСЯ
ДО НАЧАЛА РЕПЛИКАЦИИ ДНК
© 2007 г. Р. Э. Узбеков
Группа "Клеточный цикл" Отдела электронной микроскопии, НИИ физико-химической биологии им А Н. Белозерского, Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова 119992 Москва; факс: (495)939-3181, электронная почта: rustuzbekov@aol.com Поступила в редакцию 29.01.2007 г.
Центросома, включающая в себя две центриоли, является структурной основой полюса веретена деления. Дупликация этой органеллы наряду с удвоением количества хромосом, т.е. репликацией ДНК, представляют собой два принципиальных события в ходе клеточного цикла при подготовке клетки к делению. В настоящей работе процесс репликации центриолей анализировали методом электронной микроскопии в клетках СПЭВ, которые были индивидуально прослежены после митоза. Было показано, что появление процентриолей отмечается уже через 5-6 ч после митоза, т.е. на 1-2 ч раньше, чем клетки этой линии вступают в S-фазу клеточного цикла при минимальной продолжительности G1-фазы. Ультраструктурный анализ центросом в клетках с известным "возрастом в клеточном цикле" в комбинации с авторадиографическим исследованием этих же клеток с использованием 3Н-тимидина прямо показал, что удвоение центриолей начинается до того, как клетки вступают в синтетическую S-фазу клеточного цикла, т.е. предшествует началу репликации ДНК.
Процесс дупликации центриолей по аналогии с процессом удвоения ДНК часто также называют "репликацией". Это связано с тем, что новая копия органеллы обычно формируется вблизи уже существующей в клетке центриоли. Так же как это было продемонстрировано ранее для ДНК [1, 2], "репликация" центриолей полуконсервативна: эксперименты с инъекцией в клетки биотинилированного тубулина показали, что в каждую из дочерних клеток попадает одна "старая" и одна новообразованная центриоль [3]. Однако при более детальном рассмотрении становится очевидным, что механизмы процессов репликации ДНК и "репликации" центриолей существенно различаются.
К настоящему времени накоплены обширные данные о способах появления центриолярных цилиндров в клетках различных типов. Эти способы могут быть разделены на две основные группы. В первом случае новые центриолярные цилиндры возникают de novo, т.е. вне связи с уже существующими [4-7]. Во втором случае они появляются вблизи уже имеющихся в клетке центриолей или базаль-ных телец, что характерно для большинства типов клеток. Процесс "репликации" центриолей не имеет аналогов по своему механизму - новая копия создается не на реплике старой, а перпендикулярно ей. При этом между материнской и дочерней цен-триолями остается некоторое расстояние, заполненное тонкофибриллярным материалом, связывающим оба центриолярных цилиндра [8].
На каждой материнской центриоли в клетке обычно закладывается по одному новому центрио-лярному цилиндру, который Ж. Гэлл предложил
называть "процентриоль" [8]. В большинстве клеток, таким образом, строго поддерживается соответствие количества центриолярных цилиндров количеству геномных копий хромосом (плоидно-сти клетки): в диплоидной клетке в в1-фазе клеточного цикла две центриоли, а в тетраплоидной клетке в в2-фазе - четыре [9]. При полиплоидиза-ции клеток такое соответствие до определенной степени сохраняется [10].
В отличие от ДНК, удвоение которой можно выявить при анализе включения меченых предшественников, начало удвоения центриолей можно надежно показать только с помощью электронной микроскопии. Данные, полученные при исследовании ультраструктуры центриолей в клетках на различных стадиях клеточного цикла, позволили соотнести события клеточного и центриолярного циклов [9, 11]. Е. Стабблфилд предложил по аналогии с клеточным (ядерным) циклом подразделить цен-триолярный цикл на фазы, выделив фазы созревания, репродукции и расхождения центриолей [11]. Е. Роббинс с соавт. [9] впервые полностью описали основные события центриолярного цикла соматических клеток. По данным этих авторов, первая структурная перестройка центросомы после митоза происходила в ранней в1-фазе и заключалась в потере типичной для митотических клеток взаимно перпендикулярной ориентации центриолей. Таким образом, к фазам созревания, репродукции и расхождения была добавлена стадия дезориентации [9]. В отличие от фаз ядерного цикла, которые сменяют друг друга, фазы центриолярного цикла чаще всего перекрываются. В частности, в значитель-
ной части клеток некоторых типов центриоли расходятся уже в G1-фазе сразу после фазы дезориентации [12], в других типах клеток расхождение происходит уже после начала дупликации центри-олей, т.е. в процессе фазы созревания [13].
Наибольшее внимание исследователей при соотнесении событий ядерного и центриолярного циклов всегда привлекал вопрос о том, что начинается раньше - дупликация центриолей или репликация ДНК? По этому вопросу единого мнения у разных авторов пока нет. С одной стороны, по данным Е. Роббинс с соавт. [9], в синхронизованных клетках HeLa при доле клеток в S-фазе около 20% ранние стадии репликации центриолей были обнаружены в 65-70% клеток, что свидетельствует о том, что по крайней мере в части клеток этот процесс начинался в G1-фазе клеточного цикла. С другой стороны, в одной из классических работ по ультраструктурному анализу центриолярного цикла, проведенному на клетках СПЭВ, процентрио-ли вблизи материнских центросом были обнаружены только в ходе S-фазы клеточного цикла [14].
Независимость начала дупликации центриолей от синтеза ДНК была экспериментально показана в работах [15, 16]. В общих чертах описан и механизм клеточной регуляции удвоения центросом [17-19].
Однако исследований, позволяющих установить относительную последовательность событий ядерного и центриолярного циклов на клетках с известным "возрастом в клеточном цикле", пока проведено не было.
В настоящей работе с помощью ультраструктурного анализа центросом на серийных срезах клеток, индивидуально прослеженных после митоза, в комбинации с авторадиографическим исследованием было прямо показано, что в клетках СПЭВ дупликация центриолей может начинаться до начала репликации ДНК.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Прижизненные наблюдения клеток. В работе были использованы клетки линии СПЭВ (почка эмбриона свиньи). Клетки культивировали в термостате при 37°С в атмосфере 5% с02 в среде 199 с добавлением 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота ("Вектор", Россия) и антибиотиков. Для экспериментов клетки рассевали на покровные стекла и культивировали в чашках Петри. Для прижизненных наблюдений была сконструирована и изготовлена специальная камера, имеющая внешний металлический корпус и те-флоновый сердечник, закрываемый сверху и снизу круглыми, расположенными параллельно друг другу покровными стеклами диаметром 25 мм. Объем камеры составлял 1.25 мл. Для смены среды сердечник был оснащен двумя силиконовыми
трубками. Благодаря малой толщине стекол и их строгой параллельности достигалось высокое качество фазового контраста (объектив Plan-Neoflu-ar 40/0.9, "Opton", ФРГ). При наблюдении и фотографировании клеток был использован оранжевый светофильтр при минимальном освещении. Температура камеры на столике микроскопа поддерживалась с помощью фена. Клетки фотографировали (экспозиция составляла несколько секунд) с помощью фотонасадки МФН-12 два-три раза до завершения ими митоза и далее примерно один раз в час вплоть до момента фиксации.
Авторадиография и электронная микроскопия. Для приготовления препаратов для авторадиографического исследования в течение последнего часа перед фиксацией клетки культивировали в полной кондиционированной среде с добавлением [3Н]тимидина (400 кБк/мл). Далее клетки фиксировали в 2.5% растворе глутарового альдегида ("Fluka", ФРГ) на фосфатном буфере (pH 7.4), до-фиксировали тетраоксидом осмия ("Agar Scientific LTD", Великобритания), обезвоживали в спиртах и ацетоне и заливали в смолу EPON-812 по стандартной методике. После полимеризации смолы стекла отделяли от блоков с клетками в жидком азоте, поверхность блоков покрывали при слабом красном свете ядерной эмульсией типа "М" (НИИХИМФОТОПРОЕКТ, Россия). Несколько контрольных образцов того же блока, покрытых эмульсией одновременно с образцом, содержащим индивидуально прослеженные клетки, были использованы для определения оптимального времени экспозиции, которое составило 10 сут. Автограф проявляли, после чего с помощью светового микроскопа, оснащенного фазово-контрастной системой, по сделанным ранее прижизненным фотографиям находили экспериментальные клетки и фотографировали их. Серийные ультратонкие срезы (70 нм) этих клеток были получены, используя ультратомы LKB-III и LKB-V ("LKB", Швеция). Срезы были перенесены на бленды, покрытые формваровой пленкой, и дополнительно контрастированы путем инкубации в 4% водном растворе уранилацетата (25 мин), окрашены цитратом свинца по Рейнольд-су, исследованы и сфотографированы на электронных микроскопах HU-11, HU-12 ("Hitachi", Япония) или Philips CM-12 ("Philips", Нидерланды).
РЕЗУЛЬТАТЫ
Проведенное в настоящей работе детальное ультраструктурное исследование клеток СПЭВ, индивидуально прослеженных после митоза, показало, что репликация центриолей обнаруживается значительно раньше, чем этого можно было ожидать на основании результатов предыдущего исследования [14], даже если продолжительность Gx-фа-зы была минимальной. Настоящая работа была изначально инициирована данными, полученными
Рис. 1. Авторадиографическое исследование клетки и ультраструктура центросомы через 7 ч 23 мин после начала анафазы митоза. а-в - Прижизненное наблюдение клетки. На фотографиях указано время, прошедшее после начала анафазы (часы и минуты), на фотографии в дополнительно указано время введения в среду культивирования [3Н]тимидина. г - Фотография после фиксации и проявления автографа, на фотографии указано время, прошедшее от анафазы до момента фиксации клеток. д - Схема контуров клеток, соответствующая полю наблюдения в фазовом контрасте (г) и малом увеличении при электронно-
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.