МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2015, том 49, № 4, с. 592-600
ГЕНОМИКА. ТРАНСКРИПТОМИКА
УДК 577.218
ДВА ГЕНА Elov^-ПОДОБНОЙ ЭЛОНГАЗЫ Cyprinus carpio var. Jian: ХАРАКТЕРИСТИКА ГЕНОВ, ЭКСПРЕССИЯ мРНК И ПИЩЕВАЯ РЕГУЛЯЦИЯ*
© 2015 г. H.-T. Ren1*, Y. Huang1, Y.-K. Tang2, J.-H. Yu2, P. Xu2
1Animal Science and Technology College, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471003, China 2Key Laboratory of Genetic Breeding and Aquaculture Biology of Freshwater Fishes, Ministry of Agriculture, Freshwater Fisheries Center, Chinese Academy of Fishery Sciences, Wuxi 214081, China Поступила в редакцию 25.09.2014 г.
Принята в печать 07.11.2014 г.
Элонгаза Elovl5 — ключевой фермент, который участвует в биосинтезе высоконенасыщенных жирных кислот (HUFA). На настоящий момент информации по эволюции и функциональным особенностям генов Elovl5-a и Elovl5-b карпа обыкновенного (Cyprinus carpio var. Jian) очень мало. В данном исследовании расшифрованы геномные последовательности и структуры двух предполагаемых генов Elovl5-ro-добной элонгазы в составе генома карпа обыкновенного. Нами исследованы паттерны мРНК-экспрес-сии генов Elovl5-a и Elovl5-b в тканях вылупившихся личинок и молоди карпа в условиях пищевой регуляции. Показано, что у этих двух генов Elovtë-подобной элонгазы организация участков, кодирующих 8 экзонов, идентична, в то время как интронные области различаются как по длине, так и по и составу. Это не аллельные варианты одного гена. Оба гена элонгазы Elovl5 высокоэкспрессированы в печени, кишечнике (pyloric caeca) и мозге. Экспрессия мРНК Elovl5-a и Elovl5-b усиливается в период от выклева личинок до 20 суток после него. В печени, мозге и кишечнике (pyloric caeca) карпа обыкновенного проанализирована регуляция экспрессии Elovl5-a и Elovl5-b в ответ на потребляемые им жирные кислоты в составе следующих источников питания: 1) рыбьего жира, богатого n-3 HUFA; 2) кукурузного масла, богатого 18:2n-6 HUFA; или 3) льняного масла, богатого 18:3n-3 HUFA. Кроме того, в печени, мозге и кишечнике рыб, которых кормили жирными кислотами различного происхождения, проанализирована дифференциальная экспрессия генов Elovl5-a и Elovl5-b. В ходе дальнейших исследований будут изучены механизмы дифференциальной экспрессии генов Elovl5-a и Elovl5-b в различных тканях и роль транскрипционных факторов в регуляции синтеза HUFA.
Ключевые слова: Сургтт еагрт уаг. Лап, Е1оу15-подобная элонгаза, характеристика гена, экспрессия мРНК, пищевая регуляция.
TWO ELOVL5-LIKE ELONGASE GENES IN Cyprinus carpio var. Jian: GENE CHARACTERIZATION, mRNA EXPRESSION, AND NUTRITIONAL REGULATION, by H.-T. Ren1*, Y. Huang1, Y.-K. Tang2, J.-H. Yu2, P. Xu2 (1Animal Science and Technology College, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471003, China; e-mail: hthn2012@163.com; 2Key Laboratory of Genetic Breeding and Aquaculture Biology of Freshwater Fishes, Ministry of Agriculture, Freshwater Fisheries Center, Chinese Academy of Fishery Sciences, Wuxi 214081, China.). Elovl5 elongase is a critical enzyme involved in the highly unsaturated fatty acid (HUFA) biosynthesis. There is very little information on the evolution and functional characterization of Elovl5-a and Elovl5-b genes in common carp (Cyprinus carpio var. Jian). In the present study, the genomic sequences and structures of two putative Elovl5-like elongase genes in the common carp genome were obtained. The mRNA expression patterns of Elovl5-a and Elovl5-b in tissues, hatching carp embryos, and juveniles under nutritional regulation were investigated. The results show that the two Elovl5 elongase genes have similar organization, coding 8 exons of high identity and introns of distinct size and sequence composition. They are not allelic variants of a single gene. Both Elovl5 elongase genes are highly expressed in liver, intestine (pyloric caeca) and brain. Elovl5-a and Elovl5-b mRNAs showed increased expression from newly hatched to 20 days after hatching. The regulation of Elovl5-a and Elovl5-b in response to dietary fatty acid composition was determined in liver,
Принятые сокращения: CO (corn oil) — кукрузное масло; DAH (days after hatching) — сутки после вылупливания; DHA (docosahexaenoic acid) — докозагексаеновая кислота; EPA (eicosapentaenoic acid) — эйкозапентаеновая кислота; FO (fish oil) — рыбий жир; hpf (hours post fertilization) — часы после фертилизации; HUFA (highly unsaturated fatty acids) — высоконенасыщенные жирные кислоты; LA (linoleic acid) — линолевая кислота; LNA (a-linolenic acid) — а-линолевая кислота; LO (linseed oil) — льняное масло; PUFA (polyunsaturated fatty acids) — полиненасыщенные жирные кислоты.
# Текст представлен авторами на английском языке.
* Эл. почта: hthn2012@163.com
brain and intestine (pyloric caeca) of common carp fed with diets: (i) fish oil (FO) rich in n-3 HUFA, (ii) corn oil (CO, 18:2n-6) or (iii) linseed oil (LO, 18:3n-3). Also the differential expression of Elovl5-a and Elovl5-b genes in liver, brain and intestine in common carps fed with different oil sources was studied. Further work aimed at the determination of the mechanisms of differential expression of the Elovl5-a and Elovl5-b in different tissues and the roles of transcription factors in regulating HUFA synthesis is in progress.
Keywords: Cyprinus carpio var. Jian, Elovl5-like elongase, gene characterization, mRNA expression, nutritional regulation.
DOI: 10.7868/S0026898415040138
Элонгазы высокодлинноцепочечных жирных кислот (very-long-chain fatty acyl elongases, Elovl) — это связанные с мембраной эндоплазматическо-го ретикулума белки, ответственные за первую регуляторную ступень (конденсация активированной жирной кислоты с малонил-КоА) процесса элонгации жирных кислот, которые синтезируются de novo или добавлены в пищу [1]. Они относятся к генному семейству, состоящему из семи членов (у мышей и у людей), которые различаются как по субстратной специфичности к жирным кислотам, так и по пространственным и временным паттернам экспрессии [2]. Из семи Elovl-белков элонгазы Elovl5 — ключевые ферменты пути биосинтеза HUFA [3, 4]. Для нескольких видов пресноводных рыб: полосатый данио (Danio rerio), нильская тиляпия (Oreochromis niloti-cus), атлантический лосось (Salmo salar) и радужная форель (Oncorhynchus mykiss) — получены кДНК элонгазы Elovl5 [5—8]. В основном считают, что у пресноводных рыб происходит конвертация С18-полиненасыщенных жирных кислот (PUFA) в С20/22 HUFA; однако степень конвертируемости варьирует, что зависит от вида рыбы и коррелирует с присущей им способностью к деса-турации ацил-жирных кислот и элонгации [9].
Число хромосом у карпа обыкновенного удвоено по сравнению с другими карповыми, вот почему для этого вида рыбы вполне реально присутствие двух различных генов, кодирующих один и тот же пептид [10]. Таким образом, карпа обыкновенного (C. carpio) обычно относят к тетраплои-дам благодаря большому числу хромосом и высокому содержанию ДНК. Информация о том, что у атлантического лосося ферменты Elovl5a и Elovl5b различаются по активности и, видимо, отличаются на функциональном уровне [11—13], привела к гипотезе, что карпу обыкновенному может быть присущ сложный механизм регулирования биосинтеза HUFA. Ранее клонированы два гена Elovl5-подобной элонгазы (названные Elovl5-a и Elovl5-b) карпа обыкновенного [14], однако знаний по ним пока явно не хватает. В качестве необходимого звена для понимания роли и механизмов действия двух Е^^-подобных генов в ходе синтеза HUFA мы исследовали паттерны экспрессии мРНК Elovl5-a и Elovl5-b на стадии эмбрионов и выклева личинок карпа обыкновен-
ного, а также при регулировании пищевого рациона его молоди. Полученные результаты позволят понять молекулярный механизм биосинтеза HUFA у полиплоидного вида рыбы и определиться с выбором источников липидов при разработке рецептуры корма для карпа обыкновенного.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Рыба и сбор образцов. Карпа обыкновенного (Cyprinus carpio var. Jian) вылавливали на базе Ис-ин (Yi Xing) Научно-исследовательского центра пресноводного рыбного хозяйства Китайской Академии наук рыбного промысла (Freshwater Fisheries Research Center, Chinese Academy of Fishery Sciences). Эмбрионы карпа выращивали при 28°C и собирали через 1, 12, 24, 48, 72 и 96 ч после оплодотворения (hpf). Личинки карпа растили и отбирали пробы на 1, 5, 10, 15, 20, 25 и 30 сут после выклева (DAH). Собранные эмбрионы и личинки замораживали в жидком азоте и хранили при —70°C до выделения РНК.
Образцы тканей молоди карпа обыкновенного (~40 г) собирали для изучения вариаций экспрессии элонгазы Elovl5. Кишечник, печень, мышцы, почки, сердце и мозг шести карпов замораживали при —70°C и хранили до выделения из них РНК. Суммарную РНК экстрагировали с помощью Tri-zol Reagent Kit ("Takara", Япония), и 2 мкг использовали для получения кДНК с помощью обратной транскриптазы M-MLV ("Takara"). ПЦР проводили со следующими парами праймеров: Elovl5aF-Elovl5aR, Elovl5bF-Elovl5bR и P-act-inF—P-actinR (табл. 1). ПЦР-продукты разделяли электрофорезом в 1%-ном агарозном геле и анализировали в цифровой системе изображений Kodak Image Station ("Kodak 2000R").
Эксперимент по исследованию пищевой регуляции экспрессии элонгазы Elovl5 проводили на молоди карпа обыкновенного (45—50 г), которую растили в девяти стеклянных танкерах (3 повтора на каждую обработку) и содержали на одной из трех диет с одним и тем же основным составом (35% белка и 6% масла), но различавшихся по источнику жирных кислот: рыбий жир (FO, жирные кислоты 20:4n-6, 22:6n-3 и 20:5n-3), кукурузное масло (CO, 18:2n-6) и льняное масло (LO,
18:3n-3). По окончании эксперимента из девяти рыб каждого диетического рациона вынимали печень, мозг и кишечник (pyloric caeca) и замораживали при —70°C до выделения РНК.
Геномное клонирование Elovl5-подобной элонгазы. Суммарную ДНК экстрагировали из венозной крови карпа обыкновенного, используя набор Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0 ("Takara"). В результате выравнивания полноразмерной последовательности кДНК с геномной последовательностью Д
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.