БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ
Том 19 * № 2 * 1993
УДК 547.857,7'455.057 : 577.113.6
© 1993 г. М. О. Тактакишвили, М. X. Карузерс *
ДВА ПОДХОДА К КРУПНОМАСШТАБНОМУ СИНТЕЗУ ОЛИГОНУКЛЕОТИДДИТИОАТОВ
Химический факультет Тбилисского государственного университета им. И. Джатхишвили, Тбилиси;
* Химический факультет университета штата Колорадо, Боулдер, Колорадо
Осуществлен крупномасштабный синтез олиготимидиндитиоатов. Триэфирным методом синтеза в растворе получены димеры и тетрамеры (в миллимольных количествах) и октамер (0,1 ммоль). С помошью твердофазного синтеза на ПЭГ в качестве полимера-носителя и с использованием тиоамидитного подхода получены октануклеотиддитиоаты ТвСЭг) (0,02 ммоль) и С7Т(5г) (0,12 ммоль). Хтя олигонуклеотиддитиоатов, синтезированных твердофазным методом, предложен новый способ очистки, включающий в себя отщепление защищенного олигонуклеотида от носителя, адсорбционную хроматографию на силикагеле, полное деблокирование и обращенно-фазовую хром.атог-рафию низкого давления на силикагеле С|8.
Развитие методов синтеза олигодезокси- и рибонуклеотидов идет по пути использования двух основных подходов. Во-первых, это сравнительно медленный триэфирный метод синтеза в растворе [1—10], позволяющий синтезировать ДНК в довольно значительных количествах, необходимых для рентгенострук-турного анализа и медико-биологических исследований, особенно клинических испытаний. Во-вторых, это твердофазные методы автоматизированного синтеза для быстрого получения малых количеств олигонуклеотидного материала (порядка 1 ОЕ) для молекулярно-биологических целей. В то время как фосфотриэфирный метод [1—10] практически вышел из употребления, фосфиттриэфирный (ами-дофосфитный) [11—17] и Н-фосфонатный [18—30] методы олигонуклеотидного синтеза широко используются в* практике множества лабораторий.
В последние годы эти методы находят применение в синтезе и биохимических исследованиях искусственных аналогов ДНК, модифицированных по основанию [31—36 ] или фосфатному остатку [37—39]. В то время как модификации азотистых оснований локализованы во внутренней области ДНК-дуплекса и поэтому стерически не слишком доступны для последующих воздействий, модификации межнуклеотидной фосфодиэфирной связи затрагивают периферическую область дуплекса и открыты для различных реагентов, растворителей, белковых молекул.
Модификация межнуклеотидной связи может служить источником многообразных производных нуклеиновых кислот — фосфотриэфиров [40—43 ], метил-фосфонатов, [44], амидофосфатов [45—49], алкилфосфонотиоатов [50], фосфо-тиоатов [44, 51, 52], амидофосфотиоатов [50]. Поскольку в этих аналогах атом хирален, они, как правило, представляют собой смесь соответствующего числа диастереомеров. От этого недостатка свободны дитиоаналоги ДНК, в которых два несвязывающих кислорода межнуклеотидного фосфата заменены серой [50, 53—63 ]. Подобно природной ДНК ее дитиоаналоги ахиральны, сохраняют ионный характер межнуклеотидной связи [37 ] и устойчивы к химическому гидролизу [60]. В то же время дитиоаты устойчивы и к нуклеазам [53—56 ]. Они обладают противовирусной активностью [64—67 ] и могут представлять интерес для лечения злокачественных новообразований [65—67 ].
3* 211
Ш
Синтез полностью защищенных триэфирных нуклеотидфосфодитиоатов и ^инуклеотиддишоатов. Цифры под формулами дают значение химического сдвига в спектре Р-ЯМР (6р, м. д.)
а Г
NucOPN(Prl)2 — NucOPSßzl(cy CNEtO LcNEt6
(I)
Пв 192
NUC = [(Me 0)^ Tr]0 —i q \
Thy
5
b
—NucOPSBzl(Cip-CNEtO
m
95
S
С I
■NucOPSBzl(Cl)
<f HNEtj (Ш) 72
Vb*
Thy
0PSBzl(cy-
CNEtO Ш) 95
Nuc 0PSBzl(Ci.
0PSBzl(CV,) CMEtO
(Ю
95
a: BZL (CV.) 5И, Tetr, b: , c: Et^N - CH^CN, d: CCI^COOH/CI^CH^, e: TPS-Cl, nelm.
Дитиоаты довольно легко могут быть подвергнуты функционализации путем окисления в присутствии спиртов или аминов или же прямым алкилированием. Полученные таким образом модифицированные ДНК и РНК, содержащие спиновые метки, маркеры, реакционноспособные группировки, могут использоваться в различных биофизических и биохимических исследованиях.
Упомянутые выше методы синтеза природных олиго- и полинуклеотидов были применены также для получения дитиоаналошв ДНК. В то время как Н-фосфонатный метод синтеза олигонуклеотиддитиоатов [50, 53 ] пока находится в стадии разработки, для синтеза малых и больших количеств олигонуклеотиддитиоатов эффективными оказались тиоамидитный [68—73] и фосфотриэфирный [62] методы.
В данной работе оба эти подхода использованы для крупномасштабного синтеза олигонуклеотиддитиоатов.
Фосфотриэфирный синтез в растворе
Крупномасштабный триэфирный синтез атиготимидагадитиоатов (1—2 ммоль ди-, три- и тетрамеров, 0,1 ммоль октамера) был осуществлен исходя из 20 ммоль амидита тимидина (I). Универсальный синтон — полностью защищенный тимадиндитиоат (II) — был синтезирован взаимодействием амидита (I) с 2-кратным количеством дихлорбен-зилмеркаптана в присутствии 2,5-кратного количества тетразола [62]. Промежуточный фосфиттриэфир — ß -цианэтил-Б-дихлорбензилтиоит — без выделения был окислен элементарной серой в дитиоат (II) [62 ], который после обработки реакционной смеси и осаждения гексаном был выделен в виде белого порошка с выходом 95%. Полученный продукт может быть далее использован без хроматографической очистки.
Детритилирование осуществляли 3% трихлоруксусной кислотой в безводном хлористом метилене [62, 74] с последующей хроматографической очисткой и осаждением гексаном (выход ОН-компонента (IV) 90%). Защитную ß-циан-этильную группу удаляли непосредственно перед конденсацией действием на полностью защищенный дитиоат (II) 50% раствора триэтиламина в ацетонитриле [62], полученную триэтиламмониевую соль (III) (выход 80—90%) использовали без дополнительной очистки. Межнуклеотидную конденсацию проводили в ацетонитриле, используя 50% избыток Р-компонента (III) и 3-кратный избыток триизопропилбензолсульфохлорида в качестве конденсирующего реагента [74 ] (схема I).
Жидко- и твердофазный синтез олигонуклеотиддитиоатов
ВмеО]гТг]0 -i,0v8
Y
H0V°v __А1
у
о
SPSR1
I
о —
r'O
R«8zl(cy
»•. в-в'-т
R - Ас
6; В-С", В'-Т R*- Ас
(Ш i,б,г,А)
t: В-б'-С" г: В-б' = Т д: В'С81, В-Т
R 3 Bz
r'- СО(СН^СОО-ПЭГ
r2- со(сн,)гсоо-пзг
В течение многих лет при твердофазном синтезе олигонуклеотидов [2—20] в качестве носителей использовали исключительно нерастворимые органические и неорганические полимеры. При всех неоспоримых достоинствах этого подхода он требует использования больших избытков реагентов (прежде всего нуклео-тидного материала), необходимых для достижения высоких выходов при поэтапном наращивании олигонуклеотидной цепи. Замена нерастворимых носителей на носители, нерастворимые в неполярных, но хорошо растворимые в полярных растворителях (модифицированная целлюлоза [75], ПЭГ [76]), позволяет проводить конденсации в растворе с умеренными избытками Р-компонента и вместе с тем сохраняет одно из наиболее существенных преимуществ твердофазного метода — возможность обойтись без постадийной хроматографической очистки.
В настоящей работе в качестве второго варианта крупномасштабного синтеза олигонуклеотиддитиоатов был использован «метод твердой жидкой фазы», разработанный для синтеза коротких олигонуклеотидов [76 ]. В качестве полиме-ра-носителя был избран монометиловый эфир полиэтиленгликоля, цепь наращивали тиоамидитным методом в направлении от 3'- к 5'-концу [68—73 ]. Этим
путем был осуществлен синтез олигонуклеотиддитиоатов C?ZT(S2) (VIII6) и Te(S2) (Villa) (схема 2). Для контроля эти же октамеры были синтезированы жидкофазным тиоамидитным методом (схема 2).
Известно, что амидитный синтез олигонуклеотиддитиоатов сопровождается образованием ряда побочных продуктов [13], так что выход целевого продукта не превышает 50—55% [13]. Это обстоятельство побудило нас, прежде чем приступать к тиоамидитному синтезу длинных последовательностей, специально исследовать реакционную смесь, образующуюся при получении димеров (VII) в растворе (схема 2). Вопреки ожиданиям, спектр Р-ЯМР показал, что исходный тиоамидит (VI), взятый, согласно [13], в 2-кратном избытке, в реакционной смеси отсутствует. Таким образом, учитывая расход тиоамидита на побочные реакции, его следует брать не менее чем в 2,5-кратном избытке *.
* Использование в качестве альтернативы пирролидинфосфотиоамидиту (Vi) ere N,N-flnn3onponmibHoro аналога [72] дает худшие результаты (данные не приведены).
Катализируемые тетразолом побочные реакции промежуточных соединений, содержащих трехвалентный фосфор. Обозначения как на схеме 2
о ]
Дальнейшее изучение спектров Р-ЯМР первой и второй стадий реакции (т. е. конденсации мономеров и последующего окисления серой, схема 1) подтвердило, что основной продукт реакции — целевой динуклеотидфосфодитиоат (<5р 193 м. д. до окисления и 93 м. д. после окисления). При увеличении чувствительности, однако, дополнительно обнаруживается ряд пиков, соответствующих различным побочным продуктам, образующимся в результате сопутствующих реакций детритилирования, окисления, гидролиза и перегруппировки Арбузова с участием соединения трехвалентного фосфора, крайне нестабильного в присутствии тетразола (катализатора реакции) (схема 3).
При хроматографическом выделении продукта конденсации большинство этих побочных продуктов (III, IX—XI) было получено в индивидуальном виде и охарактеризовано спектрами 3!Р- и 'Н-ЯМР (см. «Экспериментальную часть»).
В результате контрольного жидкофазного тиоамидитного синтеза октамеров T8(S2) (Villa) C?ZT(S2) (VIII6) в масштабе 5 мкмоль было получено 38 и 34 ОЕ254, что отвечает 10% суммарному выходу при 7-стадийном синтезе октамеров.
Функционализацию ПЭГ 5'-диметокситритилтимидин-3'-сукцинатом для тиоамидитного синтеза на ПЭГ осуществили согласно методам [75, 76 ]. При этом количество иммобилизованного нуклеозида составило 155 мкмоль/г носителя. После кепирования уксусным ангидридом и детритилирования трихлоруксусной кислотой получили ПЭГ с пришитым первым звеном, готовый к сборке олиго-нуклеотидной цепи.
Новый полимерный носитель был испытан на примере синтеза октан
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.