ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2015, том 463, № 5, с. 619-623
= ФИЗИОЛОГИЯ
УДК 616.8-091.81:616-008.7:616.12-008
ДВА ПУЛА ИНТЕРНЕЙРОНОВ В БУЛЬБАРНОМ ОТДЕЛЕ СЕРДЕЧНО-СОСУДИСТОГО ЦЕНТРА КРЫС
© 2015 г. В. М. Черток, А. Е. Коцюба, Е. П. Коцюба, М. С. Старцева
Представлено академиком РАН Л.В. Розенштраухом 12.11.2014 г.
Поступило 12.11.2014 г.
У крыс популяции ^^аг с вызванной реноваскулярной гипертензией, иммуногистохимическим методом с использованием антисыворотки против нейрональной формы синтазы окиси азота, ци-статионин-в-синтазы и гемоксигеназы-2 изучали два пула интернейронов: внутриядерные (ВЯ), лежащие в проекции ядра солитарного тракта, ретикулярных гигантоклеточного и мелкоклеточного ядер, и две группы межъядерных (МжЯ): мелкие, площадью от 50 до 300 мкм2, и крупные — свыше 350 мкм2 в различные периоды (8, 16 и 24 недели) формирования реноваскулярной гипертензии. Установлено, что в центральные механизмы управления гемодинамикой могут быть вовлечены, по крайней мере, два пула интернейронов: ВЯ и МжЯ, которые различаются между собой рядом топо-химических характеристик и функциональными свойствами — различной устойчивостью к повышению кровяного давления.
Б01: 10.7868/80869565215230292
Вазоактивные нейроны по имеющимся данным составляют около 12—15% от числа нервных клеток в ядрах бульбарного отдела сердечно-сосудистого центра крыс [2]. Часть таких клеток располагается за пределами "вазомоторных" ядер, создавая отдельный пул интернейронов, находящихся в состоянии постоянного тонического возбуждения [2, 12]. Импульсы от некоторых из них достигают симпатических центров, расположенных в боковых рогах спинного мозга, стимулируя изменения гемодинамики, другие вазоактивные нейроны образуют межнейронные связи с различными ядрами ствола мозга [1, 3, 12]. Немаловажную роль в процессах межнейронных взаимодействий в последние годы отводят газотрансмиттерам — новому классу сигнальных молекул, экспрессия которых установлена не только в интернейронах, расположенных внутри вазомоторных ядер, но, как недавно было показано, и между ними [5, 14]. Нельзя исключать и того обстоятельства, что особенности локализации каждого из двух пулов интернейронов находят отражение в различиях то-похимии и функциональных свойствах этих клеток, что может проявляться в обычных условиях
Тихоокеанский государственный медицинский университет, Владивосток E-mail: chertokv@mail.ru
Институт биологии моря им. А.В. Жирмунского Дальневосточного отделения Российской Академии наук, Владивосток
жизнедеятельности организма и особенно ярко при сосудистой патологии.
Поскольку работ такого плана мы не обнаружили в доступной литературе, целью нашей работы явилось иммуноцитохимическое изучение ферментов, участвующих в образовании газотрансмиттеров во внутриядерных и межъядерных интернейронах нормо- и гипертензивных крыс. В результате проведенного исследования нами впервые установлены различия в локализации nNOS (нейрональная NO-синтаза), CBS (циста-тионин-Р-синтаза) и НО-2 (гемоксигеназа-2) в двух пулах интернейронов. Приоритетными являются данные об особенностях реакции каждого пула интернейронов на повышение артериального давления, что позволяет внести определенные коррективы в существующие представления об организации работы бульбарного отдела сердечнососудистого центра.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе использовали материал половозрелых крыс-самцов популяции Wistar, массой тела 200—240 г. У животных с реноваскулярной гипертензией (РВГ), вызванной оперативным путем, через 8, 16 и 24 нед. (по 5 крыс в каждой группе) после операции показатели систолического артериального давления (АД) составляли в среднем 174 ± 10.2 мм рт. ст. В качестве контроля использовали 5 ложно оперированных крыс с показателями давления 114.7 ± 5.4 мм рт. ст. Всех живот-
620
ЧЕРТОК и др.
ных содержали на стандартном рационе в одинаковых условиях лабораторного вивария.
Систолическое давление измеряли при помощи системы неинвазивного мониторирования кровяного давления ML U/4c501 ("MedLab", КНР) методом наложения хвостовой манжеты. Животных выводили из эксперимента передозировкой 3%-го раствора тиопентала натрия, извлекали продолговатый мозг и фиксировали его при 4°C в течение 4 ч в 4%-м растворе параформаль-дегида в 0.1 М фосфатно-солевом буфере, pH 7.4 (ФСБ). После фиксации образцы продолговатого мозга пропитывали холодным 30%-м раствором сахарозы в ФСБ и готовили криостатные срезы толщиной 30—40 мкм. Иммуноцитохимическое исследование проводили с использованием антисыворотки против nNOS, которая в физиологических условиях является морфологическим маркёром в нервных клетках оксида азота [10], CBS — сероводорода и НО-2 — монооксида углерода [8, 11].
Изучали два пула интернейронов. Первый пул — внутриядерные (ВЯ), лежащие в проекции ядра со-литарного тракта (ЯСТ), ретикулярного гиганто-клеточного ядра (РГЯ) и ретикулярного мелкоклеточного ядра (РМКЯ). Второй пул состоял из двух групп межъядерных (МЯ) интернейронов: мелких, площадью от 50 до 250 мкм2 (мМжЯ), и крупных — свыше 350 мкм2 (кМжЯ). Для этого в серии из не менее 16 последовательных срезов ка-удальной части продолговатого мозга один окрашивали метиленовым синим, второй — для исследования nNOS (NO-нейроны), третий — СВS (Н2S-нейроны), четвертый — НО-2 (НО-2-ней-роны). Пространственные отношения между этими типами клеток изучали описанным ранее методом [6].
Во всех исследуемых группах крыс вычисляли среднюю площадь профильного поля интернейронов в мкм2, их общее количество при окраске препаратов метиленовым синим, долю, приходящуюся отдельно на NO-, H2S- и НО-2-нейроны, и средний показатель оптической плотности преципитата (СПОП). Количественную обработку материала проводили с использованием автоматизированной системы анализа изображений Al-legro-MC. При статистической обработке полученных экспериментальных данных применяли критерий t Стьюдента. Результаты представляли в виде M± т. Статистически достоверными считали различия приp < 0.05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В продолговатом мозге животных определяются оба пула газотрансмиттерных интернейронов (рис. 1). Внутриядерные обычно имеют треугольную или веретеновидную форму и разный уровень интенсивности реакции. NO-нейроны в
проекции ЯСТ лежат одиночно или образуют компактные скопления, лучше выраженные в вентролатеральной части ядра. В РМКЯ эти нейроны образуют небольшие группы в разных участках ядра, в РГЯ — наиболее объемные скопления клеток выявляются в его центральной части. Площадь большинства МО-нейронов в исследованных ядрах колеблется от 280 до 420 мкм2, в среднем составляя 323.4 ± 15.8 мкм2. Н28- и НО-2-нейроны, как правило, группируются в тех же участках ядра, что и предыдущая группа клеток, однако Н28-нейроны, как правило, крупнее — их размеры варьируются от 380 до 470 мкм2 (в среднем 422.1 ± 17.4 мкм2), НО-2-нейроны, наоборот, мельче. Их площадь у подавляющего большинства клеток колеблется от 220 до 360 мкм2 (в среднем 277.8 ± 13.6 мкм2). Более мелкие или крупные газотрансмиттерные нейроны встречаются не так часто, что не позволяет их использовать для полноценного статистического анализа. Результаты сравнительного исследования показывают, что величина СПОП и доли ВЯ интернейронов, экс-прессирующих указанные выше ферменты, в значительной степени зависят от функциональной принадлежности ядра (рис. 2). Среди НО-2-ней-ронов наибольшие значения количественных показателей установлены в чувствительном ядре (ЯСТ), среди Н28 — в двигательном ядре (РГЯ, р < 0.05). МО-нейроны одинаково часто встречаются в ассоциативном (РМКЯ) и двигательном (РГЯ) ядрах (р > 0.05), хотя значения СПОП в последнем почти вдвое ниже (р < 0.05).
Между этими ядрами, а также между ядрами и проводящими путями определяются мелкие и крупные полигональные и веретеновидные им-мунопозитивные МЯ-интернейроны. Особенно часто они встречаются в вентромедиальной части продолговатого мозга на стыке РГЯ и РМКЯ, но и в этой области мозга МЯ встречаются намного реже, чем ВЯ-интернейроны (рис. 1). Среди МЯ различной медиаторной принадлежности преобладают клетки небольших размеров, площадью от 150 до 250 мкм2 (195.6 ± 13.1 мкм2). На их долю приходится не менее половины от общего числа иммунопозитивных клеток соответствующей ме-диаторной принадлежности. Многие мМжЯ отличаются высокой интенсивностью реакции, поэтому величина СПОП в них существенно выше (р < 0.05), чем в популяции ВЯ-интернейронов (рис. 1). Среди кМжЯ наиболее многочисленную группу (24—32%) составляют нейроны площадью от 350 до 500 мкм2 (375.9 ± 21.5 мкм2). Интенсивность реакции в них ниже, чем в мМжЯ (р < 0.05), и немногим отличается от показателей для ВЯ соответствующей медиаторной принадлежности (р > 0.05). Клетки мельче 100 и крупнее 500 мкм2 встречаются редко.
nNOS
ДВА ПУЛА ИНТЕРНЕИРОНОВ В БУЛЬБАРНОМ ОТДЕЛЕ CBS HO-2 nNOS CBS
HO-2
-pi
-Т' >
л * \ л
tfJHr
f
к, "fr
>' "V
РМКЯ
РГЯ
%
35 30 25 20 15 10 5 0
: -----------: :
ЯСТ ЯСТ
РМКЯ
РГЯ
мМжЯ МЯ
X *
ч
ч ;
Усл. ед. 35
25 15
кМжЯ
у
1 \ *
»
nNOS CBS HO-2 nNOS CBS HO-2
Рис. 1. Иммунопозитивные нейроны в "вазомоторных" ядрах и межъядерных областях продолговатого мозга, где мелкие клетки обозначены стрелкой, направленной влево, крупные — стрелкой, направленной вправо. Увеличение (об. х3.2, ок. х10). На графическом фрагменте по левой оси ординат — количество нейронов в процентах, результаты представлены в виде диаграммы; по правой оси ординат — значения СПОП в усл. ед., результаты — в виде линий. Нейроны, экспрессирующие nNOS — столбики серого цвета и штриховая линия, CBS — белого и сплошная линия, НО-2 — черного и пунктирная линия. ЯСТ — ядро солитарного тракта, РМКЯ — ретикулярное мелкоклеточное ядро, РГЯ — ретикулярное гигантоклеточное ядро, МЯ — межъядерные области, мМжЯ — мелкие и кМжЯ — крупные межъядерные нейроны. Здесь и на рис. 2 — M± m, n = 5.
С использованием импрегнационных методов было показано, что МЯ преимущественно небольших размеров совместно с клетками "вазомоторных" ядер участвуют в образовании локальных цепей, более крупные — о
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.