БИОХИМИЯ, 2010, том 75, вып.. 6, с. 887 - 895
УДК 577.23;57.053.2
ДВА ВИДА АММОНИЙНОГО РАЗОБЩЕНИЯ В ХЛОРОПЛАСТАХ ГОРОХА
© 2010 г. В. К. Опанасенко1*, Л. А. Васюхина2, И. А. Найдов1
1 Институт фундаментальных проблем биологии РАН, 142290Пущино Московская обл., ул. Институтская, 2; факс: (4967)330-532, электронная почта: opanasenko@hotbox.ru; opanasenko@ibbp.psn.ru
2 Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, 142290 Пущино Московской обл., ул. Институтская, 3
Поступила в редакцию 22.10.09 После доработки 13.11.09
Исследовано действие аммония на синтез ATP, перенос электронов и светоиндуцированное поглощение ионов водорода в хлоропластах гороха. Показано, что зависимость этих реакций от концентрации аммония может быть обусловлена действием двух разных процессов разобщения. Первый процесс индуцируется низкими концентрациями аммония (<0,2 мМ), второй наблюдается в диапазоне концентраций 0,5—5 мМ NH4Cl. Первый тип разобщения стимулируется пальмитиновой кислотой или N, N-дициклогексилкарбо-диимидом; второй — набуханием тилакоидов хлоропласта под действием энергозависимых осмотических градиентов. В присутствии флуоресцентного красителя сульфородамина Б, не проникающего сквозь мембрану, это набухание вызывает вход красителя в люмены. Предполагается, что аммоний активирует два разных пути утечки катионов из люмена. Первый путь относится к канальным белкам, а второй является меха-ночувствительной порой, которая открывается под действием осмотических градиентов.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: аммонийное разобщение, ионная регуляция, DCCD, хлоропласты, перенос электронов, синтез ATP.
Чтобы понять, как осуществляется регуляция процессов трансформации энергии света в хлоропластах растений, необходимо изучить влияние на эти процессы низкомолекулярных веществ — субстратов и регуляторов клеточного метаболизма. Одним из таких веществ является аммоний, который служит субстратом для глю-таминсинтаз (08) — ключевых ферментов метаболизма азота. Хлоропласты гороха содержат до 60% глютаминсинтаз листа (082). У 082 среднее значение Кт для МИ+ находится в диапазоне 0,1—0,6 мМ [1—3]. Следовательно, чтобы поддерживать активный синтез аминокислот, концентрация аммония в строме хлоропластов должна быть 0,2—0,5 мМ. Однако долгое время полагали, что она не превышает 10 мкМ [4]. Развитие аналитических методов привело к изменению этого представления. Показано, что кон-
Принятые сокращения: АИ — светоиндуцированное поглощение ионов водорода; БССБ — #,#'-дициклогек-силкарбодиимид; Уе — скорость базального переноса электронов от воды к акцепторам ФС1; МВ — метилвиоло-ген; ФС1 — фотосистема 1; Хл — хлорофилл; ЭТЦ — электрон-транспортная цепь; 08 — глютаминсинтаза.
* Адресат для корреспонденции.
центрация аммония в водной фазе апопласта листьев томата и листовой ткани рапса составляет от 0,1 [2] до 1,0 мМ [3, 5].
Аммоний в виде аммиака свободно проникает через мембрану, поэтому он легко теряется во время выделения органелл. Поскольку аммоний не обнаруживается в хлоропластах in vitro, ранее NH+ не рассматривался как эндогенный регулятор энергетики хлоропластов.
При стационарном освещении хлоропласта аммоний накапливается в тилакоидных люменах в соответствии с величиной градиента pH. Аккумулированные аммонийные катионы компенсируются анионами хлора, пришедшими в люмен из стромы. Существует общее мнение, что ионы аммония и хлора, накопленные внутри освещенного тилакоида, могут вызывать его осмотическое набухание, которое каким-то образом индуцирует утечку ионов водорода или аммония из люмена [6, 7].
У выделенных хлоропластов есть два функциональных эффекта, обусловленные действием аммония. При низких концентрациях аммоний стимулирует синтез ATP, если фотофосфо-рилирование катализируется линейным переносом электронов от воды к акцепторам ФС1 [8, 9].
С другой стороны, при концентрациях 5—10 мМ аммоний устраняет трансмембранный градиент pH, т.е. является разобщителем электронного транспорта и синтеза ATP. Оба эффекта могут быть следствием изменений катионной проводимости мембран, но до сих пор нет данных о существовании каких-либо аммонийных или аммиачных каналов в хлоропластах. Полная расшифровка генома Arabidopsis позволила показать, что плазматические и митохондриаль-ные мембраны растений содержат белки, структурно и функционально похожие на канальные белки бактериальных и животных клеток [10, 11]. Однако ни один из известных канальных белков пока не найден в тилакоидной мембране. Исследования ионной проводимости мембран проводили только с помощью электрофизиологических методов. Показано, что тилакоидные мембраны содержат потенциалзависимые калиевые каналы, которые, возможно, проводят и аммоний. Калиевые каналы с проводимостью 14 и 20 pS наблюдали в липидном бислое, в который были встроены везикулы тилакоидных мембран [12]. В мембранах тилакоидных везикул, полученных в условиях осмотического шока, зарегистрированы каналы с более высокой проводимостью - 60 pS и 40/90 pS [13, 14]. Обнаружен также неселективный канал (или пора 620 pS), через который в люмен могут проникать молекулы флуоресцентного красителя Люцифера желтого [14].
Можно предполагать, что зависимость процессов трансформации энергии в тилакоидах от концентрации аммония должна быть, по крайней мере, двухфазной - при низких концентрациях аммония функциональные эффекты определяются утечками через калийные каналы, а при высоких - утечкой через поры, которые открываются в результате энергозависимого набухания тилакоидов.
В настоящей работе исследовано аммонийное разобщение в условиях, близких к таковым в строме хлоропластов нативной клетки. Полученные данные показывают, что аммоний действительно индуцирует два вида (пути) утечки ионов водорода из люмена. Первый активируется низкими концентрациями аммония (<0,2 мМ); он стимулируется пальмитатом или ^.^'-дицикло-гексилкарбодиимидом (DCCD). Второй вид утечки реализуется при высоких концентрациях аммония. Это — мембранная пора с неспецифической проводимостью, проницаемая для флуоресцентного красителя сульфородамина Б. Пора открывается при набухании освещенных тилако-идов под действием осмотических градиентов.
Предполагается, что в низких концентрациях аммоний и пальмитат могут обеспечивать об-
ратимое эндогенное разобщение процессов трансформации энергии в хлоропластах фото-синтезирующих клеток растений.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Хлоропласты выделяли из листьев двухнедельных проростков гороха как описано ранее [15], промывали в среде, содержащей 0,2 М сахарозы, 10 мМ KCl, 5 мМ MgCl2 и 10 мМ Tricine-NaOH, pH 7,8, ресуспендировали в той же среде, и хранили в темноте при 0°. Концентрацию хлорофилла определяли методом Арнона.
Хлоропласты, обработанные DCCD, получали путем инкубации органелл (0,1 мг Хл в 1 мл) в течение 5 мин при 20° в среде хранения с 0,2 мМ DCCD. Суспензию центрифугировали в течение 10 мин при 0°, осадок ресуспендировали в свежей среде хранения.
В экспериментах хлоропласты (40 мкг хлорофилла в 1 мл) освещали красным светом (X > 600 нм) в течение 1—2 мин при температуре 20°. Аммоний добавляли в темноте перед освещением. Электронный транспорт измеряли в реакционной среде, содержавшей 0,2 М сахарозу, 10 мМ KCl, 5 мМ MgCl2, 3 мМ Hepes, 3 мМ Tricine, pH 7,8, 0,1 мМ МВ или 0,4 мМ феррицианид и хлоропласты, или с помощью электрода Кларка по поглощению/выделению кислорода, или pH-электродом по выделению H+ в реакциях сферри-цианидом. Обратимое светоиндуцированное поглощение H+ (AH) измеряли pH-электродом в средах с низкими концентрациями буферов (0,1 мМ Hepes + 0,1 мМ Tricine) и с МВ или 50 мкМ ФМС + 2 мкМ диурон. Синтез ATP рассчитывали по поглощению H+ [16] в среде, содержавшей 2 мМ KH2PO4, 0,25 мМ ADP, 2 мМ Трицина, pH 7,8, и МВ или ФМС + диурон. Концентрация сахарозы, KCl и MgCl2 была такой же, как при измерениях электронного транспорта. Шкалы pH калибровали добавлением известных количеств HCl к реакционным средам с хлороплас-тами. Разброс данных для всех измерений на хлоропластах одного выделения не превышал 5%.
Для исследования распределения флуоресценции сульфородамина и хлорофилла в хлоропластах использовали конфокальный микроскоп Leica TCS SPE. Хлоропласты выдавливали из тонких срезов молодых листьев Peperomia caperata непосредственно в реакционную среду, которую использовали также и для регистрации базального переноса электронов. Среда содержала МВ, 50 мкМ флуоресцентного красителя сульфородамина Б и добавки аммония и паль-митата, соответствующие подписям на рис. 5. Образцы помещали под микроскоп и регистриро-
вали распределение флуоресценции красителя и хлорофилла, возбуждавшейся двумя лазерами с длинами волн 488 и 635 нм. Интенсивность флуоресценции регистрировали в диапазоне 538—590 нм для сульфородамина Б и 640—750 нм для хлорофилла. 50 мкМ сульфородамин Б не влиял на функции хлоропластов.
В работе были использованы ADP, DCCD, сульфородамин Б и метилвиологен фирмы «Sigma Chemical Co», США.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Проблема изучения действия аммония на процессы преобразования энергии в тилакоидах заключается в том, что невозможно измерить трансмембранный градиент рН непосредственно, используя подходящие рН-индикаторы (например, 14С-метиламин, 9-аминоакридин или нейтральный красный). Эти зонды, как и аммоний, являются проникающими аминами, поэтому аммоний будет конкурировать с их катионами за связывание с анионными центрами в люмене [17]. Такая конкуренция может не только исказить измеряемые значения АрН, но и изменить действие аммония на функции хлоропластов. Кроме того, вариации концентрации аммония и сахарозы в реакционной среде, необходимые в настоящей работе, не позволяют определять объем люменов в каждом конкретном случае. Поэтому возможна только качественная оценка градиента рН, удобная для сравнения данных между собой. Мы измеряли параметры, зависящие от АрН, но не от объема люменов: уровень светоиндуцированного поглощения Н+, скорости базального электронного транспорта и синтеза АТР. Величина АН соответствует количеству ионогенных групп, связывающих Н+ при образовании градиента рН; скорость переноса
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.