МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2010, том 44, № 2, с. 263-274
МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ
УДК 577.21
ДВЕ ФУНКЦИИ ДОМЕНА "ЦИНКОВЫЕ ПАЛЬЦЫ" МЕТИЛ-ДНК-СВЯЗЫВАЮЩЕГО БЕЛКА КАИЗО
© 2010 г. Н. А. Жигалова#*, С. В. Женило#, Д. С. Айтхожина, Е. Б. Прохорчук
Центр "Биоинженерия"Российской академии наук, Москва 117312 Поступила в редакцию 19.05.2009 г.
Принята к печати 21.07.2009 г.
Метилирование является общим для всех позвоночных организмов процессом, одна из основных функций которого заключается в том, чтобы фиксировать транскрипционно неактивное состояние генов. Это может происходить, в частности, благодаря специальным белкам, которые специфично узнают метилированные районы ДНК и привлекают к ним белковые комплексы, репрессирующие транскрипцию. Белок Каизо является одним из таких специализированных белков и содержит два функциональных домена: К-концевой домен BTB/POZ и три "цинковых пальца" С2Н2-типа на С-конце, которыми он связывается с метилированной ДНК и привлекает к ней ре-прессионные комплексы за счет взаимодействия BTB/POZ-домена с корепрессором КСоЯ. В некоторых клеточных линиях позвоночных ортологи Каизо взаимодействуют с катенином р120, который, хотя и является преимущественно цитоплазматическим белком, иногда обнаруживается в ядре. Цель настоящего исследования — определение параметров взаимодействия белков Каизо и катенина р120, а также изучение функциональных последствий образования такого белкового комплекса с точки зрения транскрипционного контроля метилированных генов. Мы установили, что второй и третий "цинковые пальцы" белка Каизо необходимы и достаточны для взаимодействия с катенином р120. При взаимодействии с катенином р120 происходит два молекулярных события, которые приводят к инактивации Каизо как транскрипционного фактора. Во-первых, катенин р120 маскирует сигнал ядерной локализации Каизо, и Каизо в составе комплекса с р120 мигрирует из ядра в цитоплазму; и, во-вторых, связывание с р120 делает невозможным взаимодействие Каизо с метилированной ДНК. Таким образом, С-концевой домен белка Каизо выполняет две важные функции: связывание с ДНК и взаимодействие с цитоплазматическим белком катенином р120. Подробное изучение данного взаимодействия позволит определить новые механизмы ядерно-цитоплазматических сигнальных путей в клетках млекопитающих.
Ключевые слова: белок Каизо, катенин р120, домен "цинковые пальцы", метилирование ДНК, белок-белковое взаимодействие.
BIFUNCTIONAL ROLE OF DOMAIN ZINC FINGERS OF METHYL-DNA-BINDING PROTEIN KAISO, by N. A. Zhigalova*, S. V. Zhenilo, D. S. Aithozhina, E. B. Prokhortchouk (Center "Bioengin-ering", Russian Academy of Sciences, Moscow, 117312 Russia; *e-mail: nzhigalova@gmail.com). DNA methylation in mammals is one of the major epigenetic mark that associates with inactive chromatin state. Methyl-DNA-binding proteins bind methylated DNA and silence gene transcription by recruiting repression complexes. Kaiso is one of the methyl-DNA-binding proteins. It has a domain structure: N — terminal BTB/POZ domain involved in protein-protein interaction and C-terminal zinc-fingers of C2H2 type that bind methylated DNA (mCGmCG) or nonmethylated - TCCTGCNA. Here we show that Kaiso interacts with p120 catenin through zinc finger 2 and 3. This interaction has dual consequences. Firstly, binding to p120 inhibits nuclear import of Kaiso that results in most of Kaiso-p120 complexes becoming cytoplasmic. And secondly, bound p120 makes impossible interaction of the zinc fingers with methylated DNA. These modes of Kaiso modulation by p120 can open attractive perspectives in linking events on cell membrane and changes in nuclear gene expression.
Key words: protein Kaiso, p120 catenin, zinc finger domain, protein-protein interaction, cell-cell adhesion.
# — Оба автора внесли одинаковый вклад.
Принятые сокращения: BTB/POZ (Broad Complex, Tramtrak, Bric a brac/Poxvirus and Zinc fingers) — семейство транскрипционных факторов; KCC — Каизо-связывающий сайт (TCCTGCNA); NCoR (Nuclear receptor CoRepressor) — ядерный коре-прессор; HDAC3 (Histon Deacetylase) — гистоновая дезацетилаза 3; MBD1 (Methyl Binding protein) — метил-ДНК-связыва-ющий белок 1; DAPI (4'6-diamidino-2-phenylindol) — 4'6-диамидино-2-фенилиндол; GFP (Green Fluorecent Protein) — зеленый флуоресцентный белок.
* Эл. почта: nzhigalova@gmail.com
Метил-ДНК-связывающий белок Каизо относится к семейству транскрипционных факторов BTB/POZ (см. Сокращения), регулирующих скорость биологических процессов у дрозофилы и позвоночных. Большинство BTB / POZ-белков (HIC-1, Bcl-6, PLZF, ZF5, MIZ-1) выполняют у позвоночных роль онкобелков или опухолевых супрессоров [1, 2]. Как и многие из членов BTB/POZ-семейства, метил-ДНК-связывающий белок Каизо содержит два функциональных домена: N-концевой BTB/POZ-домен, участвующий в белок-белковом взаимодействии, и С-концевой домен, состоящий из трех "цинковых пальцев" типа С2Н2. Домен "цинковые пальцы" может легко формировать гибкую структуру, способную адаптироваться к структуре ДНК [3]. С помощью этого домена белок Каизо-специфически взаимодействует с метилированной ДНК (участки метилирования mCGmCG) [4] и не-метилированной ДНК-TCCTGCNA, названной Каизо связывающим сайтом (КСС) [5]. Последовательность КСС характерна для промоторов таких генов, как wntll и matrilysin-7, siamois у Xenopus laevis. До сих пор между разными группами исследователей нет полного согласия в том, какая из ДНК-свя-зывающих активностей Каизо — с метилированными участками, с КСС или с обоими участками ДНК — является основной в живой клетке. Этот белок взаимодействует с метилированной ДНК посредством 2-го и 3-го "цинковых пальцев" [4], а отрицательно влияет на транскрипцию за счет связывания с корепрессором NcoR в комплексе с гистоновой деацетилазой HDAC3 [6]. Генетический нокаут белка Каизо у мышей существенно не сказывается на их фенотипе. Однако у Каизо-/- мышей обнаружена устойчивость к возникновению рака кишечника в модели APC/Min [7]. Напротив, у лягушки X. laevis белок Каизо необходим для нормального развития, уменьшение его количества приводит к активации транскрипции генов зиготы на две стадии раньше стадии средней бластулы эмбриогенеза, эмбрионы не могут преодолеть стадию гастру-ляции, развивается апоптоз и эмбрионы погибают [8, 9].
Ранее показано, что белок Каизо служит партнером катенина p120 в дрожжевой двугибридной системе [5, 10]. Катенин р120 относится к Armadillo-семейству многофункциональных белков (a-, р-, у-катенины), вовлеченных в такие жизненно важные процессы, как клеточная адгезия, передача сигнала и экспрессия генов [11, 12]. Белки Armadillo-семей-ства входят в состав мультибелковых катенин-кадхе-риновых комплексов, основным компонентом которых является трансмембранный гликопротеин Е-кадхерин, обеспечивающий межклеточную систему адгезии эпителиальных клеток посредством взаимодействий своих внеклеточных доменов. Нарушение функционирования этой системы приводит к дефектам, связанным с метастатическим фенотипом, в 50% случаев карцином человека [13]. Ключевая
роль катенина р120 заключается в его способности посттрансляционно стабилизировать Е-кадхерин [14, 15]. Фосфорилирование Arm-доменов катенина p120 контролирует функционирование Е-кадхерина в клетках млекопитающих [16]. Его удаление приводит к дестабилизации Е-кадхерина, к нарушениям клеточной адгезии, полярности клеток и морфологии эпителия. Подобный фенотип наблюдается при развитии опухоли [17]. Катенин р120 связывает С-концевой домен Е-кадхерина через 1-5-Агт-до-мены. Взаимодействие между р120 и Каизо происходит через 1-7-Агт-домены катенина р120 и С-концевой частью белка Каизо.
Таким образом, катенин р120 может формировать белковый комплекс либо с Е-кадхерином, либо с метил-ДНК-связывающим белком Каизо. Последний не взаимодействует ни с одним из членов кадхерин-катенинового комплекса (т.е. ни с одним из следующих белков — с Е-кадхерином, а-катени-ном, плакоглобином или ß-катенином) [5]. Несмотря на то, что модель передачи внеклеточных сигналов от мембраны клетки через Е-кадхерин, катенин р120 и далее в ядро к белку Каизо и к его генам-мишеням выглядит чрезвычайно привлекательно, имеется всего лишь одна работа, свидетельствующая об этом и показавшая, что в неявной форме катете-нин р120 через белок Каизо может влиять на работу гена matrilysin-7, индуцируемого бактерией Helico-bacter pylory в эпителиальных клетках желудка человека [18, 19]. Функциональная значимость взаимодействия белков Каизо и катенина p120 остается до конца не раскрытой, что не позволяет подтвердить правомочность гипотезы о возможной передаче сигнала от мембраны к ядру с участием упомянутых выше белков.
Цель нашей работы — точно картировать участки Каизо, вовлеченные во взаимодействие с катенином р120, а также выяснить, каковы функциональные последствия такого взаимодействия.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Клеточные культуры и транзиентная трансфекция.
Линии клеток HeLa (клеточная линия эпителиальной карциномы человека), HEK293 (клетки эмбриональных почек человека) и PC12 (клетки феохро-моцитомы крысы) культивировали на среде DMEM ("Invitrogen", США) при 37°С, 5% CO2 с добавлением 10% телячьей или лошадиной (для PC12) сыворотки ("Invitrogen", США) и 50 мкг / мл стрептомицина и пенициллина. Линию клеток насекомых sf9 культивировали на бессывороточной среде SFX ("HyClone", США). Перед трансфекцией клетки рассеивали в ячейки на 12-луночных планшетах. Трансфекцию проводили при помощи реагента Li-pofectamin ("Invitrogen", США) согласно инструкции производителя. Использовали 3.5—5 мкл реагента на лунку, перед трансфекцией среду культиви-
рования клеток заменяли на бессывороточную. Все опыты по трансфекции повторяли не менее трех раз.
Штаммы бактерий и дрожжей. При клонировании конструкций и экспрессии белков использовали стандартные штаммы E. coli-XL-1 Blue и BL21. В дрожжевой двугибридной системе Cytotrap ("Strat-agene", США) использовали мутантный, чувствительный к температуре, штамм дрожжей Saccharo-myces cerevisiae (cdc25Ha, cdc25Ha).
Плазмиды и конструкции. Для получения конструкци
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.