РАДИАЦИОННАЯ БИОЛОГИЯ. РАДИОЭКОЛОГИЯ, 2012, том 52, № 1, с. 31-38
= МОЛЕКУЛЯРНАЯ РАДИОБИОЛОГИЯ
УДК [57+61]:539.1.047:614.856:612.112.94
ДВУНИТЕВЫЕ РАЗРЫВЫ ДНК В ЛИМФОЦИТАХ ЧЕЛОВЕКА ПОСЛЕ ОДНОКРАТНОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ ИМПУЛЬСНО-ПЕРИОДИЧЕСКОГО РЕНТГЕНОВСКОГО ИЗЛУЧЕНИЯ В МАЛЫХ ДОЗАХ: НЕЛИНЕЙНАЯ
ДОЗОВАЯ ЗАВИСИМОСТЬ
© 2012 г. С. А. Васильев1, *, Е. Ю. Степанова2, О. П. Кутенков3, А. А. Беленко2, Л. П. Жаркова2, 3, М. А. Большаков2, 3, И. Н. Лебедев1, В. В. Ростов3
1НИИмедицинской генетики СО РАМН, Томск 2Томский государственный университет, Томск 3Институт сильноточной электроники СО РАН, Томск
Цель исследования — изучение и анализ влияния дозы и частоты импульсов импульсно-периодиче-ского рентгеновского излучения на количество двунитевых разрывов ДНК в лимфоцитах периферической крови человека и динамику их репарации in vitro. Для оценки количества повреждений в клетках и их восстановления был использован анализ флуоресцентных фокусов белков yH2AX и 53BP1. Дозовая зависимость количества радиационно-индуцированных фокусов белков репарации ДНК характеризовалась отклонениями от линейности в сторону повышения эффекта в диапазоне 12—32 мГр и снижением эффекта относительно ожидаемого при дальнейшем увеличении дозовой нагрузки до 72 мГр. Дозовая зависимость при воздействии в дозах больше 100 мГр была линейной. Кроме того, количество фокусов yH2AX и 53BP1 зависело от частоты импульсов импульсно-перио-дического рентгеновского излучения — максимальный генотоксический эффект был зарегистрирован при воздействии с частотой 13 имп./с. При этом наблюдалась замедленная динамика исчезновения радиационно-индуцированных фокусов, образованных после воздействия импульсно-пери-одического рентгеновского излучения в дозах, вызывающих отклонение от линейной дозовой зависимости.
Импульсно-периодическое рентгеновское излучение, малые дозы, радиочувствительность, радиацион-но-индуцированные фокусы, yH2AX, 53BP1, нелинейная зависимость от дозы.
Относительно недавно для медико-биологических исследований были разработаны источники рентгеновского излучения, способные генерировать импульсно-периодическое рентгеновское излучение (ИПРИ) в режиме с частотами повторения импульсов от единиц до сотен в секунду, длительностью импульсов в несколько наносекунд и в дозах от 10 мкГр до нескольких мГр за импульс [1]. В ранее проведенных исследованиях было обнаружено, что воздействие ИПРИ в малых дозах с частотами повторения импульсов в диапазоне 8—22 имп./с эффективно ингибирует пролиферацию клеток мастоцитомы Р-815, карциномы Эрлиха и клеток HeLa [2]. Для этих результатов, описывающих цитотоксический эффект ИПРИ, общим и характерным было то, что величина эффекта зависела от частоты повторения импульсов и дозы излучения.
* Адресат для корреспонденции: 634050 Томск, ул. Набережная р. Ушайки, 10, НИИ медицинской генетики СО РАМН; тел.: (3822) 51-31-46; факс: (3822) 51-37-44; e-mail: stas.vasilyev@gmail.com.
Двунитевые разрывы ДНК являются наиболее значимыми для клетки повреждениями хромосомного материала при воздействии ионизирующего излучения [3]. Несмотря на успешное восстановление большинства из них, цепи ДНК, не репарированные или неправильно репарирован-ные от разрывов, могут приводить к образованию хромосомных аберраций и гибели клеток [4]. В клетке в ходе ответа на действие ионизирующего излучения наблюдается образование так называемых радиационно-индуцированных фокусов белков репарации ДНК [5]. Они являются динамическими структурами, содержащими тысячи копий белков гистона Н2А, участвующих в различных этапах репарации ДНК от двунитевых разрывов и передаче сигналов. Эти структуры могут оцениваться микроскопически в виде дискретных фокусов уИ2АХ [6]. Так как количество радиацион-но-индуцированных фокусов уИ2АХ точно отражает количество двунитевых разрывов, принято считать, что фокусы уИ2АХ локализуются в местах двунитевых разрывов ДНК [7, 8]. Среди белков, участвующих в образовании радиационно-индуцированных фокусов, особое значение при-
Использованные в эксперименте суммарные поглощенные дозы и время воздействия на лимфоциты периферической крови человека ИПРИ в условиях in vitro
Частота, имп./с Доза за импульс, мГр Время воздействия, мин
0.003 0.008 0.018 0.040 0.080
8 1.44 3.84 8.64 19.20 38.40 8.33
13 2.34 6.24 14.04 31.20 62.40 5.13
25 4.50 12.00 27.00 60.00 120.00 2.67
дается фосфорилированному гистону H2AX и ме-диаторному белку 53BP1, играющим важную роль в репарации ДНК от двунитевых разрывов [7, 9, 10]. Сообщалось, что колокализованные в одном участке клеточного ядра флуоресцентные фокусы белков yH2AX и 53BP1 более точно отражают динамику репарации ДНК от двунитевых разрывов в клетках, чем отдельно фокусы белка yH2AX [11].
Учитывая важность и необходимость изучения генотоксических эффектов воздействия ИПРИ в малых дозах целью настоящего исследования было установление влияния дозы и частоты повторения импульсов ИПРИ на количество радиаци-онно-индуцированных двунитевых разрывов ДНК в лимфоцитах периферической крови человека и динамику репарации ДНК от них.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА
Выделение лимфоцитов периферической крови. В качестве материала в исследовании использовали лимфоциты периферической крови двух здоровых индивидов (1 мужчина, 1 женщина). Забор крови из локтевой вены производили в вакуумные пробирки типа Vacutainer ("BD Bioscience"), покрытые изнутри натриевой солью гепарина в качестве антикоагулянта. Лимфоциты из периферической крови выделяли с помощью центрифугирования в градиенте (р = 1.077) Фикол-веро-графина ("ПанЭко"). После выделения клетки суспендировали до концентрации 3 х 106 клеток/мл в среде RPMI 1640 с добавлением 10%-ной сыворотки крови плодов крупного рогатого скота — fetal blood serum (FBS) ("Sigma"). Полученную клеточную суспензию разделяли на порции по 3 мл в пластиковые центрифужные пробирки (Greiner) и транспортировали во льду для проведения воздействия ИПРИ.
Воздействие импульсно-периодическим рентгеновским излучением. В качестве источника им-пульсно-периодического рентгеновского излучения использовалось тормозное излучение электронов сильноточного электронного пучка на аноде ускорителя "Sinus 150" (ускоряющее напряжение 260 кВ, сила тока 4 кА, максимальная энергия 90—100 кэВ, длительность импульса 4 нс).
Во время облучения пробирки с культурой клеток размещали на определённом расстоянии от анода ускорителя, что обеспечивало требуемую дозу. Измерения доз производили на различных расстояниях от коллектора (3—70 см) вдоль оси системы с использованием термолюминесцентного дозиметра "КДТ-02М" (Россия) и электростатического дозиметра с кварцевым волокном серии "Arrow-Tech" модель "138-S" (США) [1]. Лимфоциты периферической крови подвергали воздействию 4000 импульсов ИПРИ с частотами повторения импульсов 8, 13 и 25 имп./с в дозах 0.003; 0.008; 0.018; 0.04 и 0.08 мГр/имп. (таблица).
Иммуноокрашивание. После облучения клетки транспортировали во льду и инкубировали в термостате при 37°С для оценки динамики репарации ДНК через 30 мин, 2 ч и 18 ч. Фиксацию клеток проводили в соответствии со следующим протоколом. Через 30 мин, 2 ч и 18 ч после воздействия ИПРИ отбирали часть клеточной суспензии, центрифугировали 5 мин при 200 g при +4°С, удаляли надосадочную жидкость и к клеточному осадку прибавляли раствор фосфатного буфера (PBS). После повторного центрифугирования в тех же условиях в пробирках оставляли 50 мкл клеточной суспензии, которую наносили на предметные стекла, покрытые полилизином для улучшения адгезии (Menzel). Препараты накрывали покровным стеклом и оставляли на 10 мин, после чего покровное стекло удаляли и препараты фиксировали в 3%-ном растворе пара-формальдегида в течение 20 мин при +4°С. После дальнейшей отмывки в PBS проводили пермеабилизацию клеток в 0.2%-ном растворе Triton X-100 ("Sigma") в течение 10 мин при +4°С. Затем препараты отмывали по 5 мин в трех сменах PBS и помещали в 3%-ный раствор FBS на 30 мин при +4°С.
Для иммуноокрашивания были использованы следующие первичные антитела: моноклональ-ные мышиные антитела к белку yH2AX ("Novus") и поликлональные антитела кролика к белку 53BP1 ("Novus"). Вторичными антителами, несущими флуорохромы, были мышиные антитела к иммуноглобулинам кролика ("Novus"), конъюги-рованные с флуоресцеин изотиоционатом (FITC), и кроличьи антитела к иммуноглобулинам мыши ("Novus"), конъюгированные с рода-
мином. На препараты наносили по 50 мкл раствора первичных антител в 3%-ном FBS в концентрации 1 : 1000, оставляли инкубироваться в течение 1 ч при комнатной температуре. После отмывки в трех сменах PBS по 5 мин повторяли инкубацию в течение 1 ч при комнатной температуре с раствором вторичных антител в 3%-ном FBS (1 : 1000). Затем препараты, отмытые в трех сменах PBS по 5 мин, окрашивали раствором DAPI ("Sigma") в конечной концентрации 0.3 мкмоль/л, после чего наносили антиокислительный агент для микроскопирования, который предотвращает быстрое выцветание флуоресцентного сигнала под действием ультрафиолетового излучения — 10%-ный глицерин и 0.2%-ный диазобицикло-2,2,2-октан (DABCO) ("Sigma"). Поле, в котором проходило иммунное окрашивание, накрывали покровным стеклом. Препараты хранили до микроскопирования в темноте при +4°С.
Получение изображений и оценка фокусов белков репарации ДНК. Визуализация флуоресцентных сигналов осуществлялась на микроскопе Axio Imager M1 ("Zeiss") при увеличении в 1200 раз. Съемку производили с помощью трех фильтров (синий — DAPI, красный — родамин, зеленый — FITC). Съемка с помощью синего фильтра производилась в одной фокальной плоскости для получения контуров ядер клеток. С красным и зеленым фильтрами получали изображения с семи фокальных плоскостей с шагом в 1 мкм между плоскостями с дальнейшим слитием в одно результирующее изображение. Учитывая, что средняя толщина ядер лимфоцитов составляет около 7 мкм, эта процедура позволила получить информацию о наличии флуоресцентных фокусов по всей толщине ядер клеток. На каждом препарате производилась оценка количества фокусов белков yH2AX, 53BP1 и колокализованных фокусов об
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.