МИКРОБИОЛОГИЯ, 2004, том 73, № 1, с. 80-88
= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 579.81.083.18(517-285.2)
ECTOTHIORHODOSINUS MONGOLICUM GEN. NOV., SP. NOV. -НОВАЯ ПУРПУРНАЯ СЕРНАЯ БАКТЕРИЯ ИЗ СОДОВОГО ОЗЕРА МОНГОЛИИ
© 2004 г. В. М. Горленко1*, И. А. Брянцева*, Е. Е. Пантелеева*, Т. П. Турова*, Т. В. Колганова**, 3. К. Махнева***, А. А. Москаленко***
*Институт микробиологии РАН, Москва **Центр "Биоинженерия" РАН, Москва ***Институт фундаментальных проблем биологии РАН, Пущино Поступила в редакцию 21.04.03 г.
Новая неподвижная пурпурная серная бактерия (штамм М9) была выделена из степного содового озера Дзун Улдзийн Нур (рН 9.4, минерализация 3.3%) расположенного в Северо-восточной Монголии. Отдельные клетки имеют вид вибриона размером 0.3-0.5 х 0.7-1 мкм. Часто при делении клетки не отделяются друг от друга, образуя почти замкнутое кольцо. Внутренние фотосинтетические мембраны представлены концентрическими ламеллами выстилающими клеточную стенку. Фотосинтетические пигменты: бактериохлорофилл а и каротиноиды спириллоксантиновой серии. Основным каротиноидом (>96%) является сририллоксантин. В мембранах присутствуют два типичных светособирающих комплекса (LH1 и LH2) в соотношении 1 : 1. Анаэроб. Факультативный фо-тоорганогетеротроф. Фотолитоавтотрофный рост на сульфиде очень скудный. Использует тиосульфат в качестве донора электронов только в присутствии органических веществ. Глобулы элементной серы образуются в качестве промежуточного продукта окисления сульфида и тиосульфата и откладываются вне клеток. Конечный продукт окисления сульфат. В присутствии сульфида и карбонатов ацетат, лактат, малат, пируват, пропионат, сукцинат, фумарат используются как дополнительные источники углерода при аноксигенном фотосинтезе. В витаминах не нуждается. Алка-лофил, максимльный рост при рН 8.3-9.1, пределы рН 7.6-10.1. Оптимум концентрации NaCl в среде 1-7%, пределы 0.5-9%. Оптимум содержания карбонатов в среде 2% и пределы 1-10%. Наилучший рост происходит при 30-35°С. Содержание Г+Ц в ДНК 57.5 мол. %. По данным анализа последовательностей гена 16S рРНК новый изолят М9 относится к филогенетическому кластеру, объединяющему представителей семейства Ectothiorhodospiraceae, входящего в класс гамма-проте-обактерий. В данном кластере новый изолят образует отдельную ветвь, занимающую промежуточное положения между представителями родов Ectothiorhodospira и Thiorhodospira. На основании фе-нотипических и генетических свойств новая пурпурная серобактерия выделена в новый вид нового рода семейства Ectothiorhodospiraceae с названием Ectothiorhodosinus mongolicum gen. nov., sp. nov.
Ключевые слова: алкалофилы, пурпурные серные бактерии, семейство Ectothiorhodospiraceae, Ectothiorhodosinus mongolicum gen. nov., sp. nov., содовые озера.
Пурпурные серобактерии входят в Филум BXII Proteobacteria, Класс III "Gammaproteobacteria" [1] порядка "Chromatiales". Порядок подразделен на два семейства: Chromatiaceae и Ectothiorhodospiraceae. Это подразделение аргументировано как генетическими, так и фенотипическими различиями членов данных семейств. Для представителей семейства Ectothiorhodospiraceae характерно внеклеточное отложение глобул серы в процессе окисления восстановленных соединений серы: сульфида или тиосульфата. Семейство долгое время было представлено умеренно галофильными видами рода Ectothiorhodospira и экстремально галофильными видами рода Halorhodospira [2]. Некоторые ви-
1 Адресат для корреспонденции (e-mail: vgorlenko@mail.ru).
ды, принадлежащие к этим родам, являются алка-лофилами. Среди экстремально галофильных изолятов описаны, как "красные", содержащие бактериохлорофилл а, так и "зеленые", содержащие бактериохлорофилл Ь, виды. В диагнозе семейства БйоШюгЯо^ркасеае было указано, что все его члены имеют внутриклеточные мембранные структуры в виде стопок ламелл [3]. Позднее данное семейство пополнилось новым родом и видом Thiorhodospira siЬirica [4]. Бактерии рода Thiorhodospira обладают рядом отличительных свойств, одно из которых необычные фотосинтетические мембраны. Они представлены длинными прядями ламелл, которые пронизывают всю клетку, оставляя островки цитоплазмы, и никогда не располагаются в упорядоченные стопки
ламелл, как у всех остальных видов Ectothiorho-dospiraceae. Кроме того, эти бактерии откладывают серу не только вне клеток, но и в периплазма-тическом пространстве клеток так, что отложения серы выглядят как внутриклеточные.
Из степного содового озера, расположенного в Северовосточной Монголии, нами была выделена алкалофильная пурпурная серобактерия штамм М9, c нетипичными для других представителей Ec-tothiorhodospiraceae признаками. Она имела неподвижные, мелкие, изогнутые клетки, содержащие фотосинтетические мембраны в виде периферийных кольцевых ламелл, откладывала внеклеточную серу при окислении восстановленных серных соединений. По данным анализа последовательностей олигонуклеотидов 16S рДНК эта бактерия принадлежит к кластеру семейства Ectothiorhodospi-raceae, имея значительную удаленность от известных представителей этого семейства. В данной статье бактерия штамм М9 описывается как новый род и вид Ectothiorhodosinus mongolicum gen. nov., sp. nov.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Источник выделения. Пурпурная серная бактерия штамм М9 была выделена из образца разлагающихся прибрежных водорослей и циано-бактерий, прибитых ветром к береговой линии степного содового озера Дзун Улдзийн Нур, расположенного в Северовосточной Монголии неподалеку от города Чайбалсана. Общая минерализация воды в озере в период отбора проб была 3.3%, содержание сульфатов 0.08%, щелочность 180 мМ (бикарбонаты 85 мМ, карбонаты 95 мМ), рН 9.4. Вода имела характерный запах сульфида.
Выделение и культивирование. Для культивирования пурпурной серобактерии штамм М9 использовали среду следующего состава (на 1 л дистиллированной воды): 0.5 г KH2PO4; 0.5 г NH4Cl; 30 г NaCl; 0.2 г MgCl2 ■ 6Н2О; 0.1 г CaCl2; 5 г NaHCO3; 5 г Na2CO3; 1 г Na-ацетат; 0.1 г дрожжевой экстракт; 0.5 г Na2S2O3 ■ 5H2O; 0.3 г Na2S ■ ■ 9H2O; 20 мкг витамина В12; 1 мл раствора микроэлементов [5], pH 9. Очистку культуры проводили на агаризованой (0.7%) среде того же состава, повторно высевая колонии из предельных разведений. Чистоту культуры контролировали микро-скопированием и посевами на агаризованую среду в анаэробные и аэробные условия. На жидких средах бактерию культивировали в 50-мл стеклянных флаконах с завинчивающимися крышками. Посевы экспонировали при освещенности 2000 лк и температуре 30-35°С.
Изучение морфологии и тонкого строения клеток. Морфологию бактерии изучали с помощью светового микроскопа с фазовым контрастом, а также под электронным трансмиссионным микроскопом. Тотальные препараты целых
клеток для электронной микроскопии контрастировали 1%-ной фосфовольфрамовой кислотой (ФВК). Ультраструктуру микроорганизма изучали, как описано ранее [4]. Просмотр срезов и тотальных препаратов осуществляли на электронном микроскопе Jeol JEM 100С (Япония) при ускоряющем напряжении 80 кВ.
Изучение пигментного состава клеток. Пигментный состав бактерии исследовали в грубой фракции хроматофоров, в супернатанте после центрифугирования разрушенных ультразвуком клеток, а также в ацетон-метаноловых экстрактах. Спектры поглощения снимали на спектрофотометре СФ 56 (ЛОМО, Россия) в диапазоне длин волн 350-1000 нм или спектрофотометре UV-160 ("Shimadzu", Япония) в диапазоне длин волн 2001100 нм. Спектры поглощения светособирающих комплексов регистрировали непосредственно в геле. Хроматофоры выделяли после разрушения клеток ультразвуком с помощью дифференциального центрифугирования. Методика электрофореза в полиакриламидном геле, для выделения комплексов подробно описана ранее [6]. В ней была сделана одна модификация: вместо сильного неионного детергента Тритона Х-100 был использован более мягкий - додецилмальтозид.
Для экстракции каротиноидов 1 мл хроматофоров бактерии оптической плотностью при 850 нм 40-50 ед. добавляли к 10 мл смеси ацетон-метанол (7 : 2) при непрерывном перемешивании. К полученному экстракту последовательно добавляли 2-4 мл петролейного эфира, 20-25 мл воды и перемешивали. Экстрагированные пигменты локализовались в петролейном эфире на вершине указанной смеси. Их отбирали с помощью пипетки, переносили в пенициллиновый пузырек и высушивали под током азота. Полученную пленку пигментов растворяли в хлористом метилене и наносили на колонку 25 мкл экстракта.
Анализ пигментов проводили методом ЖХВД, как описано [7] на колонке Spherisorb ODS2 5 мкм 4.6 х 250 мм ("Waters", Англия). Установка для ЖХВД состояла из насоса LC 10ADvp с модулем FCV 10Alvp, который позволял создавать градиент растворителей при низком давлении (оба прибора - "Shimadzu", Япония), спектрофотометра UV160 ("Shimadzu", Япония) с ЖХВД ячейкой, интегратора 2000 ("Merck", Германия) и коллектора фракций 201 ("Gilson", Франция). Скорость подачи растворителя составляла 1 мл/мин. Колонка была уравновешена смесью состоявшей из 77% ацетонитрил-вода (9 : 1) и 23% этилацетата, которая пропускалась через колонку первые 3 мин. Затем эта смесь линейно замещалась этилацета-том в течение 37 мин, и 3 мин через нее пропускали чистый этилацетат. Фракции пигментов собирались коллектором в автоматическом режиме. Их спектры поглощения регистрировали на спек-
трофотометре UV-160. Концентрацию каротино-идов рассчитывали исходя из соответствующих коэффициентов экстинции и объема полученной фракции как описано в работах [8].
Определение состава изопреноидных хинонов клеток. Масс-спектры хинонов регистрировали на масс-спектрометре Финниган МАТ 8430 (Бремен, Германия) с системой обработки данных SS-300 при ускоряющем напряжении 3 кВ, энергии ионизирующих электронов 70 эВ, температуре источника ионов 250°С, температуре испарения образца 150-170°С, применяя систему прямого ввода вещества в область ионизации [9].
Изучение физиологии. Для определения спектра используемых органических субстратов за основу брали минеральную питательную среду с сульфидом (0.3 г/л), тиосульфатом (0.5 г/л) и дрожжевым экстрактом (0.05 г/л) в качест
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.