БИОХИМИЯ, 2014, том 79, вып. 6, с. 675 - 683
УДК 577.152
ЕДИНСТВЕННЫЙ ДИСУЛЬФИДНЫЙ МОСТИК В МОЛЕКУЛЕ ТЕРМОФИЛЬНОЙ КСИЛАНАЗЫ SYXYN11 ИГРАЕТ РЕШАЮЩУЮ РОЛЬ В ЕЕ ТЕРМОСТАБИЛЬНОСТИ
© 2014 Ш. Йин1#, Ю. Джао2#, М.Ц. Ву3*, Т.Д. Цзу1, Ю. Зенг2, К.Ф. Панг3
1 School of Biotechnology and Key Laboratory of Carbohydrate Chemistry and Biotechnology, Ministry of Education, Jiangnan University, 1800 Lihu Road, 214122 Wuxi, China; fax: +086(510)8532-9042, E-mail: yinxinat2008@126.com 2 School of Pharmaceutical Sciences, Jiangnan University, 1800 Lihu Road, 214122 Wuxi, China; fax: +086(510)8532-9042, E-mail: yaoyaosunshine@sina.cn
3 Wuxi Medical School, Jiangnan University, 1800 Lihu Road, 214122 Wuxi, China; fax: +086(510)8532-9042, E-mail: biowmc@126.com
Поступила в редакцию 30.11.13 После доработки 06.12.13
На основе известной структуры генной последовательности (EU591743) высокотермостабильной ксилана-зы EvXyn11TS из семейства 11, синтезировали ген Syxyn11, кодирующий термофильную ксиланазу SyXyn11 и несущий синонимические кодоны, характерные для дрожжей Pichia pastoris. Анализ результатов гомологического выравнивания аминокислотных последовательностей различных ксиланаз из семейства 11 показал, что только фермент SyXyn11 содержал дисульфидный мостик Cys5—Cys32 в своей ^-концевой части. Это могло свидетельствовать о важности вклада ^-концевого дисульфидной связи в термостабильность этого фермента. Для подтверждения такого предположения ген Syxyn11 был подвергнут направленной сайт-специфической мутации, приводящей к созданию гена Syxyn11C5T и соответственно к точечной замене Cys5^Thr в кодируемом белке SyXyn11C5T. Затем обе рекомбинантные ксиланазы (reSyXyn11 и reSyXyn11C5T) были экспрессированы в клетках дрожжей P. pastoris GS115 с выходом около 35 ед/мл суспензионной культуры и очищены до гомогенного состояния; их специфические активности составили 363 и 344 ед/мг белка соответственно. Оптимальная температура для реакции катализа составляла 85 и 70°, а термостабильность — 80 и 50°для рекомбинантных ферментов reSyXyn11 и reSyXyn11C5T соответственно. Заметных различий в оптимальных значениях рН и рН-стабильности у обоих ферментов не наблюдали.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: ксиланаза, термостабильность, дисульфидный мостик, направленный сайт-специфический мутагенез.
Ксиланазы (эндо-р-(1,4)-ксиланазы, ЕС 3.2.1.8) являются гликозид-гидролазами, катализирующими гидролиз внутренних р-(1,4)-Б-ксило-зидных связей ксиланов — наиболее важных ге-мицеллюлоз, входящих в состав клеточных стенок растений. На основании анализа кластеров гидрофобных аминокислот и гомологическом выравнивании аминокислотных последовательностей большинство ксиланаз были отнесены к 10 и 11 семействам гликозид-гидролаз (ОН) [1]. По сравнению с ОН семейства 10, ферменты се-
# Эти авторы внесли равнозначный вклад в представленную работу.
* Адресат для корреспонденции.
мейства 11, называемые «истинными» ксилана-зами, проявляющими каталитическую активность исключительно к Б-ксилозосодержащим субстратам, изучены наиболее полно [2]. В настоящее время термофильные ксиланазы, преимущественно относящиеся к ОН семейства 11, повсеместно потребляются в биотехнологических процессах, протекающих при высоких температурах, таких как отбеливание целлюлозной бумажной массы и производство кормов [3].
В пространственной ЗБ-структуре типичных ксиланаз семейства 11 обнаруживаются общие характерные элементы сворачивания белковой цепи, такие как одна а-спираль и два р-слоя, напоминающие частично сжатую кисть правой
руки, однако существуют и некоторые отдельные различия в структурах молекул ксиланаз из термофильных и мезофильных организмов [4]. Было установлено, что некоторые аминокислотные мотивы или отдельные области молекул ксиланаз, такие как N или С-концевые части, ди-сульфидный мостик, заряженный остаток на поверхности и солевой мостик могут влиять на термостабильность этих ферментов [5—9]. Например, образование одной единственной дисуль-фидной связи в ^концевой части ксиланазы II из мезофильного гриба Trichoderma reesei приводит к увеличению времени ее 50%-ной термоинактивации (1;1/2) при 65° с 40 с до 20 мин [10]. Развертывание (денатурация) молекул ксиланаз из 11-го семейства ОН происходит от Оконца к области р-слоя [11]. Именно поэтому процесс термоденатурации может быть приостановлен при наличии стабилизирующего мотива в ^концевой области молекулы белка [10, 12].
Ранее мы увеличили термостабильность ме-зофильной ксиланазы АоХуп11 путем замещения ее ^концевого района на аналогичный район термофильного фермента 8уХуп11 [2]. Кодирующий 8уХуп11 ген Бухуп11 был искусственно синтезирован на основе генной последовательности (Еи591743) ксиланазы .ЕгХупИ^ и адаптирован к экспрессионной системе дрожжей Р. pastoris путем использования соответствующих синонимических кодонов [13]. В последнее десятилетие было испробовано множество способов совершенствования природных ксила-наз и адаптации их к нуждам биотехнологии. Это и белковая инженерия, модификация аминокислот в составе белка, компьютерное прогнозирование структуры ксиланаз, компьютерное моделирование динамики молекулы фермента (МБ-симуляция) [14]. В представленной работе путем выравнивания гомологичных аминокислотных последовательностей нескольких мезофильных ксиланаз 11-го семейства ОН мы установили, что только 8уХуп11 содержит ди-сульфидный мостик Су85—Су832 в своем ^кон-цевом районе. Эти исследования и одновременно проведенная МБ-симуляция привели нас к предположению о том, что ^концевая дисуль-фидная связь может способствовать увеличению термостабильности белка 8уХуп11. Для экспериментального подтверждения этого мы получили новый мутантный белок (8уХуп11С5Т), несущий точечную аминокислотную замену Су85^ТЪг. Кодирующий этот белок ген Бухуп11С5Т был сконструирован методом направленного сайт-специфического мутагенеза. Затем оба гена Бухуп11 и Бухуп11С5Т были экспрессированы в клетках дрожжей Р. pastoris О8115. Рекомбинантные белки ге8уХуп11 и 8уХуп11О5Г были очищены,
охарактеризованы и сравнены по своей термостабильности и оптимальной температуре реакции катализа.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Клеточные линии, среды для культивации и используемые векторы. Для клонирования генов был использован вектор pUCm-T («Sangon», Китай), а также сконструированный и сохраняемый в нашей лаборатории в клетках E. coli JM109 рекомбинантный Т-вектор (pUCm-T-Syxyn11). Клетки E. coli DH5a и вектор pPIC9K («Invitrogen», США) были использованы для конструирования рекомбинантного вектора экспрессии. Клетки E. coli линий JM109 и DH5a культивировали в среде Лурия—Бертани (LB). Клетки дрожжей P. pastoris GS115 и трансформированные клетки дрожжей культивировали и индуцировали в средах YPD, MD, а также в средах YPD, BMGY и BMMY, содержащих генетицин G418. Все куль-туральные среды приготавливали как описано в инструкции для набора Multi-Copy Pichia Expression Kit («Invitrogen»).
Анализ первичной структуры белка. Предполагаемые участки .N-гликозилирования белков SyXyn11 и SyXyn11C5T были установлены с использованием программы NetNGlyc 1,0 (http:// www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/). Физико-химические свойства белков определяли с помощью программы ProtParam (http://au.expasy. org/tools/pro tparam.html). Поиск гомологичных последовательностей на вебсайте NCBI (http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/) проводили с использованием сервера BLAST. Гомологическое выравнивание аминокислотных последовательностей кси-налаз семейства 11 выполняли с использованием программ ClustalW2 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/ msa/clustalw2/) и DNAMAN 6,0.
Компьютерное прогнозирование термостабильности белка. Значение среднеквадратичного отклонения (RMSD), являющегося важным показателем теплового колебания атомов, определяли как диапазон отклонения ^-атома белка от его исходной конформации при высокой температуре за определенное время. Значение RMSD белка находится в обратно пропорциональной зависимости от его термостабильности [15]. Для прогнозирования устойчивости белков SyXyn11 и SyXyn11C5T в условиях повышенной температуры их SD-структуры были смоделированы с помощью программы MODELLER 9,9 (http:// salilab.org/modeller/) на основании известных данных о структуре кристалла белка EvXyn11TS (PDB: 2VUL). Полученные SD-структуры послужили объектами для MD-симуляции при 500 К в
течение 10 нс. Значения RMSD для обоих белков были рассчитаны с использованием программы g_rms из пакета программ GROMACS 4,5 (http://www.gromacs.org/) и проанализированы с помощью статистической программы Origin 9 (http://www.originlab.com/).
Оценка вариабильности вторичной структуры белка. Термостабильность белка, вплотную коррелирующая с перестройкой его SD-структуры при повышении температуры, может быть оценена путем определения вторичной структуры белка (DSSP) [16]. В данной работе SD-структу-ры SyXynll и SyXyn11C5T были подвергнуты MD-симуляции при 500 К в течение 10 нс. Затем разнообразие конформационного состояния вторичной структуры белка: спирали (а-, 3'- и п-спирали), стренды (ß-слои и ß-мостики) и петли (витки, изгибы и повороты) было установлено с использованием программы DSSP (http:// swift.cmbi.ru.nl/gv/dssp/).
Направленный сайт-специфический мутагенез. Используя плазмиду pUCm-T-Syxynll в качестве матрицы, мы амплифицировали мутант-ный ген Syxyn11C5T методом ПЦР с помощью праймеров: прямой XC5T 5'-GAATTCAACGCTC-AAACT ACT] CTTACCTCTCCAC-3' (участок рестрикции EcoRI подчеркнут, мутантный кодон заключен в рамку) и обратный XC5T 5'-GCGGC-CGCTTAACTAACAGTAATGTCAGA- 3' (участок рестрикции NotI подчеркнут). ПЦР проводили в следующем режиме: денатурация при 94° в течение 5 мин, затем 30 циклов при 94° по 30 с, при 56° в течение 30 с, при 72° в течение 40 с, элонгация при 72° в течение 10 мин. Продукт полиме-разной цепной реакции (Syxyn11C5T) был встроен в вектор pUCm-T и трансфецирован в клетки E. coli JM109. Структура рекомбинантного Т-век-тора, названного pUCm-T-Syxyn11C5T, была подтверждена путем секвенирования ДНК.
Экспрессия генов ксиланазы. Гены Syxyn11 и Syxyn11C5T были вырезаны из плазмид pUCm-T-Syxyn11 и pUCm-T-S
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.