ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2009, том 424, № 4, с. 563-566
= ФИЗИОЛОГИЯ =
УДК 612.017.1
ЭФФЕКТ ДИНОРФИНА А (1-13) НА ПРОЛИФЕРАТИВНЫЙ ОТВЕТ ЛИМФОЦИТОВ И ИЗМЕНЕНИЕ ТЫ/ТИ2 ЦИТОКИНОВОГО ПРОФИЛЯ
© 2009 г. С. В. Гейн, А. А. Сятчихин, С. П. Тендрякова
Представлено академиком В.А. Черешневым 04.05.2008 г. Поступило 13.05.2008 г.
Показано, что клетки иммунной системы экс-прессируют к-опиатный рецептор, аналогичный таковому в центральной нервной системе [1, 2]. Тем не менее по сравнению с ц-, 5-рецепторами иммунологические эффекты стимуляции к-рецеп-торов остаются слабо изученными. С высокой плотностью к-рецепторы экспрессированы на мембранах тимоцитов, в дальнейшем в процессе созревания Т-лимфоцитов плотность к-рецепто-ров на их поверхности значительно снижается [3]. к-Рецепторы, как и ц- и 5-рецепторы относятся к семейству в-протеинсвязанных рецепторов и могут образовывать димеры с 5-рецептором, образуя новую функциональную форму рецептора [4]. Эндогенные (динорфины А и В) и экзогенные (и50, 488Н и иб9, 593) к-агонисты модулируют ан-тителогенез, пролиферативный ответ и продукцию провоспалительных цитокинов [5, б].
В роли индукторов иммунного ответа выступают СБ4+-Т-клетки. В процессе формирования эффекторных клонов под воздействием факторов, продуцируемых активированными клетками естественного иммунитета (моноциты, макрофаги, дендритные клетки), СБ4+-клетки дифференцируются на две основные субпопуляции (ТЫ, ТЪ2), различающиеся по профилю синтезируемых цитокинов. ТЫ-клетки продуцируют 1БК-у, 1Ь-2, Т№-а и участвуют в клеточноопосредован-ном ответе, в то время как ТИ2-клетки продуцируют 1Ь-4, 1Ь-5, 1Ь-10 и опосредуют гуморальный иммунный ответ. Цель работы - изучить эффект стимуляции к-рецепторов фрагментом динорфи-на А (1-13) на пролиферативный ответ лимфоцитов, а также на продукцию 1Ь-4 и ¡РК-у моно-нуклеарами, очищенными СБ4+-лимфоцитами и СБ4+-лимфоцитами в присутствии моноцитов.
Лейкоциты периферической венозной крови здоровых мужчин-добровольцев, полученные пу-
Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения Российской Академии наук, Пермь
Пермский государственный университет
тем отстаивания верхнего слоя плазмы крови, культивировали в присутствии фитогемагглюти-нина П (ФГА "Sigma", 2.5 мкг/мл) в 96-луночных круглодонных планшетах в течение 72 ч. Каждая культура содержала 2 ■ 105 клеток в 0.2 мл полной питательной среды (ППС), приготовленной на основе среды 199 с добавлением 10 мМ HEPES ("Sigma"), 2 мМ L-глутамина ("Sigma"), 100 мкг/мл гентамицина и 10% ФБС ("Биолот"). За 18 ч до окончания культивирования в культуры вносили по 2 мкКи 3Н-метилтимидина. Радиоактивность проб определяли на сцинтилляцион-ном счетчике "Guardian" ("Wallac", Финляндия). Селективный агонист к-рецепторов динорфин А (фрагмент 1-13) ("Sigma") использовали в диапазоне концентраций 10-7-10-10 М.
Фракции лимфоцитов и моноцитов получали следующим образом. Выделяли фракцию моно-нуклеаров на градиенте плотности фиколл-веро-графин р = 1.077. Затем клеточную суспензию дважды отмывали, суспендировали в среде 199 и выдерживали в течение 1 ч при 4°С с целью снятия активации, вызванной выделением. Далее охлажденную суспензию мононуклеаров наносили на стерильную чашку Петри для освобождения фракции мононуклеаров от моноцитов. Чашку помещали в термостат при 37°С на 1 ч. Затем неадгезированные клетки собирали и использовали как фракцию лимфоцитов. Адгезированные клетки снимали пластиковым скребком, суспендировали в среде 199, дважды отмывали, выдерживали в течение 1 ч при 4°С и использовали как моноциты. СБ4+-Т-клетки выделяли при помощи набора магнитных бус (Dynabeads М-450 CD4, "In-vitrogen", США).
Мононуклеары, лимфоциты, CD4+-Т-клетки культивировали в количестве 2 ■ 105 в условиях, аналогичных для фракции лейкоцитов. Моноциты добавляли к CD4+-Т-клеткам в количестве 2 ■ 104 [7]. Супернатанты 48-часовых клеточных культур собирали, центрифугировали и хранили в замороженном состоянии при -20°С. Определение концентрации цитокинов производили методом твердофазного иммуноферментного анализа с использованием тест-систем "Biosource" (IL-4) (Бельгия) и "Вектор-
563
9*
564
ГЕЙН и др.
имп/мин 14 ■ 102 12 ■ 102 10 ■ 102 8 ■ 102 6 ■ 102 4 ■ 102 2 ■ 102 0
Без митогена
(а)
ФГА 2.5 мкг/мл
* *
имп/мин 14 ■ 102 12 ■ 102 10 ■ 102 8 ■ 102 6 ■ 102 4 ■ 102 2 ■ 102 0
K -7 -8 -9 -10 K -7 -8 -9 -10
Концентрация динофрина А(1-13), lg(M)
Без митогена
(б)
ФГА 2.5 мкг/мл
имп/мин 140 ■ 102
120 ■ 102 100 ■ 102 80 ■ 102 60 ■ 102 40 ■ 102 20 ■ 102 0
имп/мин 90 ■ 102
102
102
102
102
102
102
102
102
K -7 -8 -9 -10 K -7 -8 -9 -10
Концентрация динофрина А(1-13), lg(M)
Рис. 1. Влияние динорфина А (1-13) на спонтанный и ФГА-индуцированный пролиферативный ответ в лейкоцитарной взвеси (а) и фракции лимфоцитов (б) (n = 8). Одна звездочка -p < 0.05; две -p < 0.01 по отношению к контролю по парному г-критерию Фишера наименьшей значимой разницы.
Бест" (IFN-y) (Россия) в соответствии со стандартной методикой, предложенной производителем. Аналитическая чувствительность тест-систем составляла 2 пг/мл.
Статистический анализ результатов проводили с использованием однофакторного дисперсионного анализа для оценки зависимости доза-эффект и г-критерия для межгруппового сравнения. Все данные представлены в виде средней и ее стандартной ошибки (M ± m).
Установлено, что динорфин А (1-13) в концентрациях 10-7-10-8 М усиливает спонтанный и ФГА-индуцированный пролиферативный ответ
лимфоцитов в лейкоцитарной взвеси (рис. 1). Во фракции лимфоцитов динорфин А (1-13) не влияет на спонтанный пролиферативный ответ и угнетает ФГА-индуцированную пролиферацию в концентрациях 10-7-10-9 М.
При анализе влияния динорфина А (1-13) на продукцию СБ4+-лимфоцитами основных Th1, ТЬ2-поляризующих цитокинов - IL-4 и IFN-y получены следующие результаты. Как видно из рис. 2, внесение в культуры ФГА 2.5 мкг/мл во фракции мононуклеаров оказывает незначительное стимулирующее влияние на продукцию IL-4 и значительно индуцирует продукцию IFN-y. Динорфин А (1-13) 10-8 М не влияет на спонтанную и ФГА-ин-
*
ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК том 424 < 4 2009
пг/мл
14 ■ 102 -
12 ■ 102 -
10 ■ 102 -
8 ■ 102 -
6 ■ 102 -
4 ■ 102 -
2 ■ 102 -
0 I ||
к
пг/мл
5 -
4 -
3 -
2 -
1 -
ЭФФЕКТ ДИНОРФИНА А (1-13) Без митогена (а) ФГА 2.5 мкг/мл
□ MH
□ CD4+
□ CD4+moh
II
К д кд
Без митогена
(б)
К д к д к д
ФГА 2.5 мкг/мл
нд,нд| , нд, нд |
нд нд
_|_111_2J_L_
□ MH
□ CD4+
□ CD4+moh
нд нд нд
*
О
К д к д
К д
К д
К д К д
Рис. 2. Влияние динорфина А (1-13) 10 М на спонтанную и индуцированную ФГА продукцию IFN-y (а) и IL-4 (б) мо-нонуклеарами (МН), CD4+-лимфоцитами и CD4+-лимфоцитами в присутствии моноцитов (CD4 + мон) (n = 9). По оси абсцисс: К - контроль, д - динорфин А; по оси ординат - концентрация цитокина. Звездочка -p < 0.05 по отношению к контролю по парному г-критерию Стьюдента. нд - концентрация цитокина была ниже аналитической чувствительности тест-системы.
*
0
дуцированную продукцию IFN-y всеми исследуемыми нами фракциями и в то же время активирует ФГА-индуцированную продукцию IL-4 моно-нуклеарами и CD4+-лимфоцитами в присутствии моноцитов, не влияя на уровень IL-4 в культуре очищенных CD4+-клеток.
Таким образом, стимуляция к-рецепторов приводила к усилению пролиферативного ответа во фракции лейкоцитов независимо от присутствия митогена и определялась присутствием моноцитов. Ранее было показано стимулирующее влияние динорфина А на пролиферативный ответ спленоцитов мыши и продукцию ими IL-2 и IL-1P [6, 8]. В то же время низкомолекулярные к-агони-сты U50,488H и U69,593 угнетали продукцию антител in vitro, продукцию макрофагами TNF-y, IL-1, IL-6 и ответ на Т-клеточный суперантиген, что указывает на зависимость направленности эффекта от химической природы агониста [6]. Полученный нами угнетающий эффект динорфина А на пролиферацию во фракции лимфоцитов может быть обусловлен усилением апоптотических процессов в отсутствие костимулирующих сигналов со стороны моноцитов [9] и увеличением концентрации внутриклеточного цАМФ в лимфоцитах [10]. Все три типа опиатных рецепторов (ц, 5, к)
в нервной ткани опосредуют снижение уровня внутриклеточного цАМФ, однако при использовании в качестве объекта очищенных фракций клеток иммунной системы показана способность, в частности 5-агонистов, повышать уровень внутриклеточного цАМФ и угнетать интенсивность пролиферативных процессов [1]. Аналогичное динорфину А действие на пролиферативный ответ ранее было зарегистрировано у Р-эндорфина [11].
данные, полученные при анализе продукции IL-4 и IFN-y CD4+-Т-клетками, основными продуцентами данных цитокинов, указывают на Th2-поляризующий эффект стимуляции к-рецепторов, а также на зависимость IL-4-стимулирующе-го эффекта динорфина А от присутствия факторов, продуцируемых моноцитами. В этой роли могут выступать, в частности, IL-1P, простаглан-дин E2 и ряд других белков и медиаторов, продукция которых модулируется эндогенными лиган-дами опиатных рецепторов [6].
Работа поддержана грантом программы Президиума РАН "Молекулярная и клеточная биология" и грантами РФФИ (проекты 07-04-96011-р-a, 08-04-00424-а).
доклады академии НАУК том 424 < 4 2009
566
ГЕЙН и др.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Sharp B.M. // Brain Behav. Immunol. 2006. V. 20. P. 9-14.
2. Suzuki S., Chuang L.F, Doi RH. et al. // Intern. Immu-nopharmacol. 2001. V. 1. P. 1733-1742.
3. Ignatowski T.A., Bidlack J.M. // J. Pharmacol. and Exp. Ther. 1999. V. 290. P. 863-870.
4. JordanBA, Devi L.A. // Nature. 1999. V. 399. P. 697-700.
5. Alicea C, Belkowski S., Eisenstein T.K. et al. // J. Neu-roimmunol. 1996. V. 64. P. 83-90.
6. BidlackJ.M. // Clin. Diagnos. Lab. Immunol. 2000. V. 7. № 5. P. 719-723.
7. Wu MX, Ao Z, Daley J.F. et al. // J. Immunol. Meth. 1997. V. 206. P. 153-162.
8. Ni X, Lin B.C., Song C.Y. et al. // Neuropeptides. 1999. V. 33. № 2. P. 137-143.
9. Singhal P C, Sharma P., Kapasi A.A. et al. // J. Immunol. 1998. V. 160. P. 1886-1893.
10. KavelaarsA., BallieuxR.E., Heijnen C.J. // Brain Behav. Immunol. 1990. V. 4. P. 171-17
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.