ГЕНЕТИКА, 2007, том 43, № 7, с. 1002-1005
УДК 58.071:577.152.277:633.71
КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ
ЭФФЕКТИВНАЯ ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА ЭКСТРАКЛЕТОЧНОЙ РИБОНУКЛЕАЗЫ Zinnia elegans В РАСТЕНИЯХ ТАБАКА Nicotiana tabacum SRI
© 2007 г. С. С. Сангаев1, Е. Ä. Трифонова1, С. Е. Титов1, Ä. В. Романова1, Я. С. Колодяжная1, М. Л. Комарова1, М. В. Сапоцкий2, В. И. Малиновский2, Ä. В. Кочетов1, В. К. Шумный1
1 Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук, Новосибирск 630090; e-mail: trifonova.k@rambler.ru 2 Биолого-почвенный институт Дальневосточного отделения Российской академии наук,
Владивосток 690022 Поступила в редакцию 04.07.2006 г. Окончательный вариант получен 04.10.2006 г.
кДНК экстраклеточной рибонуклеазы Zinnia elegans клонирована под контролем конститутивного промотора 35S РНК вируса мозаики цветной капусты и перенесена в растения табака Nicotiana tabacum SR1. Показано, что полученные первичные трансформанты растений табака характеризуются высоким уровнем рибонуклеазной активности.
Изучение механизмов устойчивости к патогенам привело к пониманию, что компоненты межклеточного пространства играют ключевую роль во взаимодействиях растений с патогенами [1]. Одним из таких компонентов могут быть обнаруженные у растений экстраклеточные рибонуклеазы, которые индуцируются в ответ на поранение [2, 3].
Экстраклеточные рибонуклеазы могут выполнять различные специализированные функции в межклеточном пространстве. Например, S-PHKазы гаметофитно-самонесовместимых растений из семейств Solanaceae, Rosaceae и Scrophu-1апасеае одновременно выполняют функции распознавания и цитотоксичного агента, что позволяет аллель-специфично ингибировать рост пыльцевых трубочек и таким образом предотвращать инбридинг [4]. Экстраклеточные S-подобные РНКазы задействованы в механизмах защиты от грибковых патогенов [5, 6].
Мы предположили, что экстраклеточные рибонуклеазы растений, индуцируемые в ответ на поранение, являются активным компонентом противовирусной защиты на начальных этапах инфекции [7]. Экстраклеточные рибонуклеазы могут прямо гидролизовать геномную РНК вирусов на некоторых стадиях инфекционного процесса. С другой стороны, возможно, что экстраклеточные нуклеазы проникают в поврежденные в процессе инфицирования и поранения клетки, что приводит к гибели как вируса, так и клетки-хозяина.
Показано, что при инфицировании путем механического повреждения листьев табака вирусом табачной мозаики с добавлением в инокулюм активной РНКазы А существенно снижается сте-
пень поражения растений [6]. Быстрая индукция экстраклеточных S-подобных рибонуклеаз в ответ на поранение показана у Arabidopsis thaliana, Nicotiana glutinosa, Zinnia elegans и Lycopersicon es-culentum [2, 8-10]. У A. thaliana в ответ на поранение индуцируются экстраклеточная рибонукле-аза RNS1 и еще как минимум три другие нуклеазы. Причем RNS1 детектируется не только в месте поранения (локально), но и в удаленных неповрежденных тканях (системно). Системная индукция RNS1 в ответ на поранение указывает на то, что эта РНКаза может быть задействована в механизмах защиты от фитопатогенов [2]. У N. glutinosa описана РНКаза NGR3, индуцируемая в ответ на инокуляцию ВТМ [3]. В отличие от РНКаз, индуцируемых поранением, эта РНКаза индуцируется только через 48 ч после поранения.
Создание трансгенных растений с измененным уровнем активности конкретных рибонуклеаз является одним из перспективных подходов для изучения физиологической роли этих ферментов [11]. В работе использовали гетерологичный ген, кодирующий экстраклеточную рибонуклеазу Zinnia elegans ZRNase II. Известно, что экспрессия данной рибонуклеазы индуцируется в ответ на поранение [9].
Суммарная РНК была выделена из механически поврежденного листа Z. elegans через 2.5 ч после поранения. С помощью обратной транскрипции с использованием праймеров oligo(dT) (НП АО "Силекс М") была получена суммарная кДНК с последующей амплификацией. Подбор последовательностей праймеров был осуществлен на основании известной нуклеотидной последовательности кДНК ZRNase II [9]. (П1: 5'-ACACTCGAGCACA-
CAAACATGAAGA и П2: 5'-GAATCTAGAAATT-TAGAATGAAGGA). Для проведения последующего клонирования в нуклеотидные последовательности синтезированных праймеров были включены сайты рестриктаз XhoI и XbaI. Фрагмент кДНК, полученный в результате амплификации, был клонирован в плазмиду pRT104 [12] по сайтам рестриктаз XhoI и XbaI под контролем промотора 35S РНК вируса мозаики цветной капусты. Далее кДНК с промотором, белок-кодиру-ющей частью гена РНКазы, содержащей нуклео-тидную последовательность лидерного пептида, а также сигналом полиаденилирования была ампли-фицирована с помощью полимеразной цепной реакции с праймерами (pRTf: 5'-CAGGTCGACATG-GTGGAGCA и pRTr: 5'-GGAATTCGATTAAGT-TGGGTA), содержащими сайты рестриктаз Sali и EcoRI. Полученный ПЦР-продукт был клонирован в вектор рВН01 [13] по сайтам Sali и EcoRI с образованием плазмиды pBi-RNS. Т-ДНК полученной плазмиды содержит ген неомицинфосфо-трансферазы II под контролем нопалинсинтазного промотора Ti-плазмиды Agrobacterium tumefaciens (селективный маркер, определяющий устойчивость к канамицину) и белок-кодирующую часть целевого гена под управлением сильного конститутивного промотора 35S вируса мозаики цветной капусты. Следует отметить, что у Z. elegans ZRNase II секретируется в межклеточное пространство [9]. Поскольку в нашей конструкции белок-кодирующая часть гена содержит нуклео-тидную последовательность лидерного пептида, то можно ожидать, что данный белковый продукт будет локализован в апопласте трансгенных растений.
Полученная плазмида использовалась для трансформации клеток A. tumefaciens (AGL0) методом прямой трансформации [14].
Для получения трансгенных растений в качестве исходных эксплантов были использованы листья трехнедельных растений табака Nicotiana tabacum SR1. Трансформация была проведена как описано ранее [15]. Было получено 24 первичных трансформанта, устойчивых к канамицину (100 мг/л). Полученные трансформанты были протестированы на наличие экспрессии ре-портерного гена неомицинфосфотрансферазы II (рисунок). Активность неомицинфосфотрансфе-разы (NPTII) в растениях тестировали по методу Рейса и соавт. [16], в дальнейших экспериментах были использованы только NPT-позитивные растения. Геномная ДНК первичных трансформантов и контрольных растений анализировалась с помощью ПЦР на наличие полноразмерной встройки целевого гена. Показано, что геномная ДНК всех проанализированных линий первичных трансформантов содержит последовательность белок-кодирующей части рибонуклеазы Zinnia elegans (данные не представлены).
1 2 3 4 5 6
Активность фермента неомицинфосфотрансферазы в экстрактах первичных трансформантов растений табака и контроля. 1 - pBi-RNS10, 2 - pBi-RNS5, 3 -pBi-RNS4, 4 - контрольное нетрансгенное растение, 5 - pBi-RNS2, 6 - pBi-RNS1.
Для измерения рибонуклеазной активности были использованы пробирочные растения 4-6-недельного возраста и растения 8-12-недельного возраста, выращенные в стандартных условиях теплицы. Оценка рибонуклеазной активности в растительных экстрактах проведена по методу [17]. Для определения рибонуклеазной активности растительный экстракт, содержащий 25 мкг суммарного растворимого белка, добавляли к суммарной РНК дрожжей как субстрату рибону-клеаз, и оптическую плотность конечного супер-натанта измеряли при 260 нм. Белок в листовых экстрактах определяли по методу [18]. В качестве контроля использовали пробу без добавления экстракта.
Результаты экспериментов по измерению рибонуклеазной активности у контрольных и трансгенных растений приведены в таблице. Рибону-клеазная активность грубых экстрактов растений, несущих ген рибонуклеазы Z. elegans, в 515 раз превышает таковую у контрольных (не-трансгенных) растений. Полученные результаты свидетельствуют, что белковый продукт функционально активен. Для подтверждения этого предположения нами были получены экстракты межклеточной жидкости по методу [19] и проведено сравнение рибонуклеазной активности этих экстрактов с активностью грубых экстрактов и остаточной активностью фракции дебриса. Как следует из таблицы, фракция апопласта у первичных трансформантов характеризуется очень высокой рибонуклеазной активностью, значительно превышающей активность фракции апопласта у контрольных растений. Высокая нуклеазная активность фракции дебриса, по нашему предположению, объясняется недостаточно полным разделением фракций.
Таким образом, в результате настоящей работы были получены первичные трансформанты табака, экспрессирующие ген экстраклеточной рибонуклеазы Zinnia elegans. Анализ экстрактов
1004 САНГАЕВ и др.
Локализация рибонуклеазной активности в первичных трансформантах табака, экспрессирующих ген экстраклеточной рибонуклеазы Zinnia elegans ZRNase II
Линии растений Средняя OD, гр. экстракт Среднеквадратичное отклонение OD, фракция апопласта OD, фракция дебриса
pBi-RNS1 17.9 1.39 19.0 19.0
pBi-RNS2 18.8 0.76 19.5 19.5
pBi-RNS5 8.6 1.03 18.0 9.0
pBi-RNS10 12.5 2.60 19.0 14.0
pBi-RNS16 4.6 1.45 3.9 3.3
pBi-RNS23 5.5 1.22 19.5 18.0
SR1 1.3 0.43 4.2 3.4
Примечание. OD - оптическая плотность при 260 нм представлена в оптических единицах. Гр. экстракт - рибонуклеазная активность в грубых экстрактах; фракция апопласта - рибонуклеазная активность во фракции межклеточной жидкости; фракция дебриса - остаточная рибонуклеазная активность экстрактов, полученных после смыва апопластной фракции.
трансгенных растений показал, что рибонуклеазная активность в экстрактах растений повышена. В целом высокий уровень нуклеазной активности в экстрактах полученных растений не сопровождается видимыми изменениями фенотипа и сроков развития (данные не представлены), что позволяет использовать эти растения для изучения роли секреторных нуклеаз, на примере рибонуклеазы Z. elegans ZRNase II, в системах индуцируемой устойчивости растений к патогенам.
Работа финансово поддержана Комплексным интеграционным проектом СО РАН № 5.3, Интеграционным проектом ДВО РАН (№ 06-II-C0-06-024), Программой Президиума РАН "Динамика генофондов ра
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.