ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2014, том 50, № 4, с. 398-407
УДК 577.112.083
ЭФФЕКТИВНАЯ СХЕМА ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОЙ УРАЦИЛ-ДНК-ГЛИКОЗИЛАЗЫ Esherichia coli ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ В ПЦР-ДИАГНОСТИКЕ
© 2014 г. А. Е. Дмитроченко, О. М. Туриянская, А. А. Гилеп, C. A. Усанов, А. В. Янцевич
Институт биоорганической химии НАНБеларуси, Минск, 220141 e-mail: dmitrochenko@iboch.bas-net.by Поступила в редакцию 8.11.2013 г.
Разработана эффективная схема получения рекомбинантной урацил-ДНК-гликозилазы Escherichia coli штамм К12, предназначенной для использования в ПЦР-диагностике, которая позволила добиться высокого выхода целевого продукта при использованием двух стадий его очистки. Ген, кодирующий этот фермент, клонирован в вектор pCWori в одной рамке считывания с шестью остатками гистидина в С-концевой последовательности. С использованием данного вектора и E. coli штамм DH5a создана экспрессионная система "хозяин-вектор" и оптимизированы условия синтеза белка. Для очистки белка использовали металло-аффинную хроматографию с последующим диализом для удаления имидазола. Выход фермента составлял не менее 60 мг целевого белка на 1 л культуральной среды. Соответствие аминокислотной последовательности рекомбинантного и нативного ферментов подтверждено методами "пептидного фингерпринта" и масс-спектрометрического анализа. Предложен экспресс-метод определения активности ферментного препарата. Установлено, что активность 1.0 мг рекомбинантного белка составляла не менее 3 х 103 ед. Рекомбинантный фермент проявлял наибольшую стабильность при рН 8.0 и ионной силе раствора, равной 200 мМ, и полностью терял активность за 10 мин при 60°С. Хранение в течение 1 г при —20°С приводило к потере не более 30% активности. В ферментном препарате отсутствовала активность ДНКазы. Свободная энергия разворачивания белковой глобулы рекомбинантной урацил-ДНК-гликозилазы равна 23.1 ± 0.2 кДж/моль. Полученные данные свидетельствуют о том, что рекомбинантный фермент можно рекомендовать к использованию в ПЦР-диагностике для предотвращения появления ложных положительных результатов, обусловленных загрязнением реакционной смеси продуктами предшествующих реакций.
DOI: 10.7868/S0555109914030209
Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) получил широкое применение в клинической диагностике [1]. Чувствительность этого метода позволяет обнаружить единичные молекулы ДНК, присутствующие в образце. Однако высокая чувствительность метода, являясь его достоинством, обусловливает и его недостатки, в том числе, возможность появления ложных положительных результатов [2]. При проведении рутинных однотипных анализов может происходить загрязнение (контаминация) помещения, одежды и даже воздуха продуктами ПЦР. Учитывая специфику анализов, проводимых с использованием ПЦР, ложный положительный результат может причинить пациенту как моральный, так и физический ущерб в результате неверно назначенного лечения. Для того, чтобы избежать появления ложных положительных результатов, разработан ряд правил и приемов, к которым относятся система организации работы в ПЦР-лаборатории и использование урацил-ДНК-гликозилазы (УДНКГ) (КФ 3.2.2.27) [3].
Фермент УДНКГ обладает способностью гид-ролизовать в молекуле ДНК гликозидную связь между урацилом и 2-дезоксирибозой. Он впервые
был выделен из E. coli в 1974 г. [4]. Оказалось, что УДНКГ E. coli является лишь одним из представителей целого семейства ферментов, удаляющих из ДНК поврежденные основания. В настоящее время родственные ферменты выделены как из эукариотических и прокариотических клеток, так и из вирусов (поксивирусов и герпевирусов), и относятся к широко распространенным и высокоспецифичным ферментам. Известны и хорошо изучены УДНКГ из E. coli, Bacillus subtilis [5], B. stearothermophilus, Termothrix thiopara, Micrococcus luteus [6] и др. В 1981 г. был выделен и охарактеризован также фермент человека [7].
Биологическая функция УДНКГ — удаление из ДНК остатка урацила, который может образовываться в ней не только путем самопроизвольного дезаминирования цитозина, но и при неправильном встраивании нуклеотида дезоксиуридинтри-фосфата (дУТФ) при синтезе ДНК. Данный фермент используется в генно-инженерной и молеку-лярно-биологической практике для исследования комплексов ДНК-белок [8], детекции точечных мутаций [9] и удаления праймеров при проведении ПЦР [10]. В настоящее время основной обла-
стью применения УДНКГ является ПЦР-диагно-стика [11].
Цель работы — разработка эффективной схемы получения высокоочищенного препарата термолабильной УДНКГ E. coli, предназначенной для применения в ПЦР-диагностике, а также изучение ее свойств.
МЕТОДИКА
В работе использовали следующие реактивы: мочевину, гуанидин-гидрохлорид, диметилсуль-фоксид (ДМСО) ("Диа М", Россия), рестрикцион-ные нуклеазы и другие ферменты, реагенты для молекулярной биологии ("New England Biolabs", США), триптон, пептон, дрожжевой экстракт, бак-тоагар ("Difco", США), изопропил-1-тио^^-га-лактопиранозид (ИПТГ), трис, ЭДТА • 2Н2О, изо-цитрат натрия, холат натрия, имидазол, ß-меркап-тоэтанол, акриламид, N,N'-метиленбисакриламид, N,N,N'N'-тетраметилэтилендиамин, глицин, NaN3,
1,4-дитиотреитол, маркеры молекулярных масс белков и ДНК для электрофореза, додецилсульфат натрия (ДДС-Na), фенилметилсульфонилфторид (ФМСФ), дитиотреитол, кумасси синий R-250 и другие реактивы ("Sigma", США). Сорбент Ni2+-IDA Сефарозу 6B синтезировали, как описано в [12] с использованием реагентов фирмы "Sigma" (США). Прямой и обратный праймеры к 16sPHK синтезированы фирмой "Праймтех" (Республика Беларусь). Для выделения ДНК использовался набор ДНК Wizard PlusSV MiniprepsDNA Purification System ("Promega", США). ПЦР проводили в ам-плификаторе "Терцик" (ДНК-технологии, Россия).
Получение вектора. Для клонирования последовательности был выбран штамм E. coli K12, подштамм W3110, ген УДНКГ которого состоит из 690 п.н. (база данных Gene ресурса NCBI, http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/gene). На основе этой последовательности были сконструированы прай-меры для клонирования, включающие сайты узнавания для рестриктаз Nde I и Sal I:
Nde I
5
CAT TATG gctaacgaattaacctggcatg3'
28 н. S8l I
5'
G T TCGAC GмTCGACTCACTCTCTGCCGGTAATACTGGCATCC3'
34 н.
После проведения ПЦР, электрофоретиче-ского разделения и выделения из геля амплифи-цированный фрагмент ДНК обрабатывали ре-стриктазами Nde I и Sаl I, а затем лигировали в вектор pXcm-Kan12 [13], обработанный теми же рестриктазами и щелочной фосфатазой. Вектор со вставкой использовали для трансформации клеток E. coli штамм DH5a. После этапа промежуточного клонирования вставку, содержащую ген ung, переносили в экспрессионный вектор pCWori (идентификационный номер EF460848.1 в базе данных GeneBank ресурса NCBI). Вставку, содержащуюся в векторе pCWori + UNG6his, се-квенировали.
Получение рекомбинантного белка. Клетки E. coli штамм DH5a трансформировали плазмидной ДНК pCWori + UNG6his и культивировали в среде LB, содержащей ампициллин (100 мкг/мл) в течение 16 ч. Полученную культуру инокулировали среду ТВ, содержащую ампициллин (100 мкг/мл), разбавляя культуру свежей средой 1 : 100, и инкубировали при 37°С и интенсивном перемешивании (180 об/мин) до достижения оптической плотности 0.6 при длине волны 600 нм. Затем снижали температуру культивирования до 26°С, скорость перемешивания до 130 об/мин и индуцировали синтез фермента добавлением ИПТГ до конеч-
ной концентрации 0.5 мМ. Одновременно повторно добавляли ампициллин (100 мг/л). После индукции клетки культивировали в течение 48 ч, затем культуральную среду охлаждали до 4° С и отделяли клетки центрифугированием при 3000 g, 15 мин. Клеточную массу ресуспендировали в буферном растворе А (50 мМ трис-НС1 буфер, рН 7.5, содержащий 20% глицерина), используя 4 мл буферного раствора на 1.0 г клеток. Суспензию клеток разрушали в гомогенизаторе ЕшикШех С5 ("Аезйп", Канада).
Полученный гомогенат центрифугировали при 35000 g, 45 мин. Супернатант наносили на колонку (10 х 100 мм) с металлохелатным сорбентом №2+-ГОА Сефароза 6В со скоростью 30 мл/ч. Сорбент последовательно промывали 10 объемами буфера W (50 мМ трис-НС1 буфер, рН 7.5, содержащий 300 мМ №С1 и 30 мМ имидазола) со скоростью 10 мл/ч. Целевой белок элюировали буфером Е (50 мМ трис-НС1 буфер, рН 7.5, содержащий 300 мМ №С1 и 250 мМ имидазола) со скоростью 4 мл/ч, собирая фракции по 1.0 мл. Содержание белка во фракциях элюата контролировали, регистрируя электронные спектры поглощения в УФ-области (методика Варбурга—Кристиана) и методом электрофореза в 12%-ном ПААГ в присутствии ДДС-№. Фракции, содержащие более
5 мг белка на 1 мл раствора, объединяли и подвергали двукратно диализу 1 х 100 (50 мМ трис-HCl буфер, рН 7.5, содержащий 100 мМ NaCl и 20% глицерина). Чистоту конечного продукта контролировали с помощью ПААГ-электрофореза в присутствии ДДС-Na. Концентрацию белка определяли по методу Брэдфорд.
Масс-спектрометрический анализ. Для установления аминокислотной последовательности полученной рекомбинантной УДНКГ использовали масс-спектрометрический анализ как исходного ферментного препарата, так и пептидов, полученных в результате обработки фермента химот-рипсином ("метод пептидного фингерпринта"). Для масс-спектрометрического анализа полученного препарата белок обессоливали и переводили в растворитель С (смесь вода—ацетонитрил (1 : 1), содержащая 0.2% HCOOH), используя ультрафильтрацию. Препарат для анализа имел концентрацию 100 мкг белка на 1 мл раствора. Протеолиз химотрипсином осуществляли по методике [14]. Полученный гидролизат растворяли в растворителе С. Масс-спектрометрический анализ ферментного препарата и смеси пептидов, полученных в результате ферментативного гидролиза, осуществляли на масс-спектрометре LCQ-Fleet ("Thermo Sci", США), оснащенном масс-анали-затором типа "ионная ловушка", в режиме иони-зации-электрораспыление при атмосферном давлении (APESI) Устанавливали следующие параметры источника ионизации APESI: поток оболочечного газа (азот) — 60 ед., поток вспомогательного газа (азот) — 10 ед., напряжение на ESI капилляре — 4.5 кВ, температура ион-транспортн
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.