УДК 577.113.6:546.82431+578.832.1:578.282
ЭФФЕКТИВНОЕ ИНГИБИРОВАНИЕ ВИРУСА ГРИППА А ЧЕЛОВЕКА ОЛИГОНУКЛЕОТИДАМИ, ЭЛЕКТРОСТАТИЧЕСКИ ФИКСИРОВАННЫМИ НА ПОЛИЛИЗИНСОДЕРЖАЩИХ
TiO2-НАНОЧАСТИЦАХ
© 2014 г. А. С. Левина*, М. Н. Репкова*, З. Р. Исмагилов**, Н. В. Шикина**, Н. А. Мазуркова***, В. Ф. Зарытова*, #
*Институт химической биологии и фундаментальной медицины, СО РАН, 630090, Новосибирск, пр. Лаврентьева, 8
**Институт катализа СО РАН, Новосибирск ***Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор", Новосибирская обл., пос. Кольцово Поступила в редакцию 14.08.2013 г. Принята к печати 14.10.2013 г.
На культуре клеток MDCK, инфицированных вирусом гриппа A человека (подтип H3N2), исследована противовирусная активность нанобиокомпозитов TiO2 •PL^DNA, в которых DNA-фрагменты электростатически связаны с наночастицами диоксида титана с предварительно иммобилизованным полилизином (PL). Показано, что TiO2^PL^DNA(v3') — нанобиокомпозит, несущий фрагмент DNA(v3'), направленный к З'-концу некодирующей области сегмента 5 вирусной vRNA, при низкой концентрации DNA(v3') в составе нанобиокомпозита, равной 0.1 и 0.2 мкМ, эффективно и специфично подавляет репродукцию вируса на 99.8 и 99.9% (т.е. в ~400 и 1000 раз) соответственно. Оли-гонуклеотид DNA(v3'), не связанный с наночастицами, или нанобиокомпозит TiO2^PL^DNA(r), несущий олигонуклеотид, некомплементарный вирусной RNA, проявляют низкую активность (подавление репродукции в 1.3 или ~3.5 раза соответственно).
Ключевые слова: наночастицы, нанокомпозиты, БИЛ-фрагменты, сайт-специфическое действие, вирус гриппа.
DOI: 10.7868/S0132342314020092
ВВЕДЕНИЕ
Вирусы гриппа, относящиеся к семейству Orthomyxoviridae, широко распространены в природе и часто являются причиной возникновения пандемий. Они поражают млекопитающих, в том числе людей, а также птиц. Геном вируса гриппа А представлен восемью одноцепочечными сегментами RNA отрицательной полярности, каждый из которых кодирует 1—2 вирусных белка: гемагглю-тинин (HA), нейраминидазу (NA), три субъединицы РНК-зависимой РНК-полимеразы (PB1, PB2 и PA), нуклеопротеин (NP), матричный белок (М1), мембранный белок (М2) и неструктур-
Сокращения: PL — поли-Х-лизин; vRNA — исходная вирусная RNA; mRNA — матричная РНК, комплементарная исходной vRNA; сRNA — реплицированная RNA, комплементарная vRNA; DNA(v3') — олигонуклеотид, комплементарный 3'-некодирующей области сегмента 5 vRNA; DNA(c5') — олигонуклеотид, комплементарный 5'-некоди-рующей области сRNA и mRNA; DNA(r) — олигонуклеотид со случайной последовательностью; префикс d в обозначении олигодезоксинуклеотидов опущен.
#Автор для связи (тел.: +7 (383) 363-51-24, эл. почта: zaryto-va@niboch.nsc.ru).
ные белки (NS1 и NS2) [1, 2]. Гемагглютинин и нейраминидаза несут антигенные детерминанты вируса гриппа и определяют его подтипы (H5N1, H3N2, H1N1 и т.д.).
При поддержке американского Управления по продовольствию и медикаментам (Food and drug administration) были разработаны лекарственные средства на основе низкомолекулярных соединений — ингибиторы мембранного белка M2 (аман-тадин и ремантадин) и нейраминидазы (озельта-мивир-тамифлю, занамивир-реленза). В последнее время отмечается, что ингибиторы нейраминидазы могут вызывать психические расстройства и быть малоэффективными, если лечение начато на вторые-третьи сутки [3]. Кроме того, геном вируса гриппа А постоянно подвергается точечным мутациям и рекомбинации сегментов, что приводит к появлению новых штаммов вируса, устойчивых к созданным лекарственным препаратам. Поэтому разработка новых эффективных лекарственных форм, селективно действующих на вирусы гриппа А, до сих пор остается актуальной проблемой.
В последние годы серьезное внимание уделяется созданию фармацевтических препаратов нового поколения на основе фрагментов нуклеиновых кислот. При разработке методов эффективного и селективного воздействия на внутриклеточные нуклеиновые кислоты-мишени, как правило, используют фрагменты РНК или ДНК, их аналоги, ДНКзимы, РНКзимы, аптамеры, малые интерферирующие РНК (siRNA), продуценты малых РНК. Все эти соединения способны узнавать определенные последовательности генов или мРНК и блокировать их функции в клетке или в составе целого организма. Поскольку препараты на основе НК направлены на определенную мишень, они способны селективно воздействовать на генетический материал клетки, и, таким образом, должны обладать максимальной эффективностью с минимумом побочных эффектов.
Известно, что фрагменты НК и их аналогов сами по себе обладают весьма низкой эффективностью проникновения в клетки. Для их доставки клетки подвергаются дополнительной обработке специальными химическими препаратами (транс-фекционными агентами) или физическому воздействию (например, электропорации).
В последние несколько лет появилось огромное число публикаций, описывающих различные системы доставки фрагментов нуклеиновых кислот в клетки (см. обзоры [4—6]), в том числе использование неорганических наночастиц [7—10]. Ранее для доставки фрагментов ДНК в клетки мы предложили использовать нанокомпозиты на основе наночастиц диоксида титана [11, 12], которые, как известно, проникают в эукариотические клетки [13, 14]. Диоксид титана широко используется в медицине как биосовместимый материал [15]. Недавние исследования показали, что TiO2-наночастицы в относительно низких дозах (до 200 мкг/мл) проявляют лишь незначительную токсичность в отношении клеток [16], бактерий [17], и животных [18]. Показано, что используемые в настоящей работе 1Ю2-наночастицы малотоксичны, и при их воздействии на клетки MDCK не превышается уровень естественной гибели клеток [19].
Для доставки фрагментов DNA в клетки с помощью 1Ю2-наночастиц мы предложили использовать нековалентную фиксацию олигонуклеоти-дов на наночастицах и разработали несколько способов получения нанокомпозитов на основе 1Ю2-наночастиц, содержащих DNA-фрагменты [20]. В том числе был предложен метод получения нанокомпозитов TiO2^PL^DNA, где фрагменты DNA были электростатически фиксированы на наночастицах, покрытых полилизином. С использованием метода конфокальной лазерной сканирующей микроскопии было показано, что полученные нанокомпозиты проникают в клетки
без привлечения специальных трансфекционных агентов или физических методов воздействия [20]. Далее необходимо было ответить на ключевой вопрос — способны ли олигонуклеотиды, будучи доставленными в клетки, взаимодействовать с нуклеиновыми кислотами-мишенями как антисенс-реагенты.
Целью настоящей работы является исследование способности DNA-фрагментов, электростатически фиксированных на наночастицах TiO2^PL и доставленных в клетки составе нанокомпозитов вида TiO2^PL^DNA, эффективно и специфично взаимодействовать с внутриклеточными нуклеиновыми кислотами-мишенями. Исследование выполнено на примере подавления вируса гриппа А человека (H3N2) в инфицированных клетках MDCK.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Выбор DNA-фрагментов для воздействия на геном вируса гриппа А
Геном вируса гриппа А содержит 8 одноцепо-чечных RNA-сегментов отрицательной полярности (vRNA). После заражения клеток вирусом гриппа вирусные vRNA транскрибируются в mRNA и реплицируются в комплементарные сRNA положительной полярности (рис. 1) [21].
В качестве мишени мы выбрали сегмент 5, кодирующий нуклеопротеин (NP), который играет ключевую роль в инкорпорации вирусного генома в клеточные ядра инфицированного организма и, тем самым, способствует дальнейшей репликации и сборке вирусных частиц [22]. Необходимо отметить, что такой выбор мишени подкреплен литературными данными. В работе [23] была исследована противовирусная активность двадцати siRNA, адресованных к шести сегментам вирусного генома (PB1, PB2, PA, NP, M и NS). Одна из исследованных siRNA, комплементарная консервативному участку гена NP, показала наибольшую противовирусную активность. Среди морфоли-новых аналогов олигонуклеотидов (содержащих морфолиновое кольцо вместо дезоксирибозы) наиболее эффективным был фрагмент, направленный на З'-некодирующий участок сегмента 5 vRNA [24].
В качестве DNA-фрагментов были выбраны олигонуклеотид DNA(v3') (табл. 1), комплементарный З'-некодирующей области сегмента 5 исходной цепи vRNA, и олигонуклеотид DNA(c5'), комплементарный DNA(v3') и, соответственно, 5'-некодирующей области сRNA и mRNA. Локализация выбранных DNA-фрагментов на сегменте 5 вирусного генома представлена на рис. 1. В качестве контрольного фрагмента использовали олигонуклеотид DNA(r) со случайной последовательностью. Последовательности исследованных
AUG
5'm7G
DNA (c5')
I Poly(A) mRNA
синтез mRNA
3'
vRNA
DNA (v3')
репликация
5' cRNA
DNA (c5')
Рис. 1. Локализации исследуемых DNA-фрагментов на сегменте 5 вирусного генома. AUG — инициирующий кодон для трансляции гена NP.
в данной работе олигонуклеотидов приведены в табл. 1.
Используя ранее описанный способ получения TiO^PL^DNA-нанокомпозитов [20], DNA-фрагменты иммобилизовали на TiO^PL-нано-частицах за счет электростатического взаимодействия между положительно заряженными аминогруппами полилизина в составе TiO2 •PL и отрицательно заряженными фосфатными группами сахаро-фосфатного остова DNA-фрагментов (рис. 2). Таким образом, были получены и исследованы нанокомпозиты TiO2 ^PL^DNA(v3'), TiO2 •PL^DNA^') и TiO2 ^PL^DNA(r).
Противовирусная активность нанобиокомпозитов Т102^РЬ^ВИЛ
Вначале мы оценили влияние TЮ2-наноча-стиц и TiO2•PL•DNA-нанокомпозита на выживаемость клеток МЭСК в отсутствие вируса. Концентрация образцов TiO2 и TiO2•PL•DNA, приводящая к 50% гибели клеток (ТС50), составляет более 1500 мкг/мл (табл. 2).
В дальнейших экспериментах была использована нетоксическая концентрация наночастиц и нанокомпозитов (5 мкг/мл), что при емкости на-нокомпозита по DNA-фрагментам, равной 20 или
40 нмоль/мг, соответствует концентрации DNA-фрагментов 0.1 или 0.2 мкМ.
Противовирусную активность нанокомпози-тов TiO2•PL•DNA(с5'), TiO2•PL•DNA(v3') и
TЮ2•PL•DNA(r), содержащих выбранные фрагменты, сравнивали, проводя эксперименты по лечебной схеме, т.е. клетки сначала заражали вирусом, а затем инкубировали
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.