ГЕНЕТИКА, 2007, том 43, № 4, с. 537-544
ГЕНЕТИКА ЧЕЛОВЕКА
УДК 575.17:599.9
ЭФФЕКТИВНОСТЬ КОРРЕКЦИОННОЙ РЕПАРАЦИИ (MMR) И МУТАЦИЯ ГЕНА MSH2 В КЛЕТКАХ КАРЦИНОМЫ ТОЛСТОГО
КИШЕЧНИКА COL0320HSR
© 2007 г. В. А. Тронов1, И. И. Крамаренко1, Е. Н. Майорова, С. Ф. Захаров2
1 Институт химической физики Российской академии наук, Москва 119991;
e-mail: tronov@chph.ras.ru 2 Медико-генетический научный центр Российской академии медицинских наук, Москва 115478
Поступила в редакцию 29.03.2006 г.
Окончательный вариант получен 20.06.2006 г.
Рак толстого кишечника (РТК) - одна из двух патологий, в которых строго доказана связь между генетическим дефектом репарации ДНК и канцерогенезом. Дефект затрагивает один из генов механизма коррекционной репарации (mismatch repair, MMR). Связь между микросателлитной нестабильностью (МСН), мутациями генов MMR и дефицитом активности MMR однозначно прослеживается в случае семейной формы колоректального рака, синдрома Линча. При этом заболевании процесс формирования опухоли инициируется биаллельной мутацией в одном из главных генов MMR - MSH2 и MLH1. Мутация одного аллеля - терминальная, присутствует во всех соматических и половых клетках организма; вторая мутация - соматическая. Инициирующая мутация при спорадическом РТК не идентифицирована, но в большой части спорадических колоректальных опухолей обнаруживаются признаки дефицита MMR. В генетических исследованиях рака часто используют клеточные линии, полученные из первичных опухолей. Две широко используемые линии колоректальных опухолевых клеток HCT116 и C0L0320HSR фенотипически соответствуют семейной и спорадической формам рака толстого кишечника. Клетки линии HCT116 (дефицитные по MMR благодаря делеции в гене MLH1, полностью инактивирующей кодируемый белок) характеризуются высокой МСН и имеют близкий к диплоидному кариотип (near diploid karyotype). Клетки C0L0320HSR микросателлит-стабильны, что свидетельствует об активной системе MMR. Вместе с тем они имеют, подобно линии НСТ116, кариотип, близкий к диплоидному, но высокую частоту спонтанных аберраций хромосом. Ранее мы показали, что количество вторичных двунитевых разрывов ДНК, индуцированных метилнитрозомочевиной, адекватно отражает функциональную активность MMR в клетке. Используя этот подход, мы оценили активность MMR в этих линиях клеток по сравнению с MMR-профицитными клетками HeLa. Показано, что клетки C0L0320HSR характеризуются низкой активностью MMR, близкой к таковой в MMR-дефицитных клетках линии HCT116. В клетках COLO обнаружена нейтральная мутация в генеMSH2 - G520A. По-видимому, эта мутация не связана с полиморфизмом, так как у 30 исследованных больных спорадическим коло-ректальным раком мы не обнаружили такой мутации.
Колоректальный рак (РТК) - одна из распространенных онкопатологий в развитых странах. Как и многие другие опухоли, он характеризуется нестабильностью генома. Большинство первичных колоректальных опухолей (около 80%) проявляют хромосомную нестабильность (chromosomal instability, CIN) [1, 2]. Опухолевые клетки с CIN-фенотипом содержат анеуплоидный набор хромосом и многочисленные структурные цито-генетические поломки. Опухоли ClN-фенотипа характерны для спорадической формы колоректального рака [3].
Примерно в 20% заболеваний РТК клетки первичных опухолей содержат близкий к диплоидному набор хромосом (near diploid karyotype [см. 17]), сочетающийся с нестабильностью генома на
уровне нуклеотидной последовательности ДНК. Это выражается в микросателлитной нестабильности (MCH) [ 4]. Такой тип нестабильности генома является следствием дефицита механизма коррекции неспаренных оснований (MMR, mismatch repair). В свою очередь, дефицит MMR обусловливается либо мутацией одного из генов системы MMR (одного из двух генов -MSH2 иMLH1), либо эпигенетическим ингибированием (гиперметилированием) функции этих генов или их промоторов [5, 6].
MCH-фенотип, ассоциированный с терминальной мутацией генов MMR, является признаком наследственного неполипозного колоректального рака, синдрома Линча [7, 8]. MCH рассматривается как маркер дефицита пострепликативной
MMR в силу их тесной взаимной связи [9]. Однако среди заболеваний спорадическим колоректаль-ным раком встречаются случаи, когда в опухолевых клетках на фоне стабильных микросателлитов (МСС), наблюдается функциональный дефицит MMR [10]. Частота таких случаев составляет не менее 20% от всех случаев заболеваний спорадическим и семейным РТК [9]. Таким образом, дефицит MMR в опухолях ассоциирован по крайней мере с 30% заболеваний РТК, и в случае спорадического рака функциональная эффективность MMR может быть показателем риска развития заболевания.
В работах [11, 12] было продемонстрировано, что дефицит MMR в колоректальных опухолевых клетках сочетается с устойчивостью к цитотокси-ческому действию монофункциональных метилирующих агентов (SN1) - метилнитрозомочевины (МНМ) и метилнитрозогуанидина. Предполагалось, что эта устойчивость связана с пониженной частотой формирования вторичных двунитевых разрывов ДНК в MMR-дефицитных клетках после действия на них метилирующих агентов [13, 14]. Недавно это предположение было подтверждено экспериментально [15] и показано, что вторичные разрывы ДНК, возникающие при функционировании MMR в ответ на действие метилирующего агента, могут служить показателем активности MMR.
В настоящей работе, используя этот подход и показатель вторичных двунитевых разрывов ДНК в ответ на действие метилнитрозомочевины, мы оценили эффективность MMR в двух линиях колоректальных опухолевых клеток (HCT116 и COLO320HSR), которые различаются по MCH-статусу. Это различие предполагает в них различную эффективность MMR. Для клеток HCT116 характерен MCH-фенотип и дефицит MMR. Последний обусловлен биаллельной мутацией гена MLH1, приводящей к инактивации кодируемого им белка. Клеточная линия COLO320HSR выведена из первичной опухоли сигмовидной кишки. Для этих клеток характерна амплификация генов C-MYC и MDR1, которые локализованы в области гомогенного окрашивания хромосом по Гимза (homogeneously staining region, HSR) [16]. Клетки широко используются в экспериментальных исследованиях, имеют MCC-фено-тип, что позволяет считать их MMR-профицит-ными. Однако в отличие от большинства опухолевых клеток с MCC-фенотипом эти клетки имеют близкий к диплоидному кариотип, характерный для MCH-клеток [17].
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Клетки. Исследования проводили на трех линиях опухолевых клеток человека. HeLa (клетки карциномы эндометрия) - MMR-профицитные
клетки, получены из банка клеточных культур Института цитологии РАН ^анет-Петербург); HCT116 - MMR-дефицитные клетки, предоставлены проф. Г.Н. Cеливановой (Каролинский Раковый Институт, Огокгольм); COLO320HSR (выделены из первичной опухоли сигмовидной кишки человека) - клетки не охарактеризованы по состоянию генов системы MMR, также были получены из банка клеточных культур Института цитологии РАН (Cанкт-Петербург). Все клетки культивировали в среде DMEM, содержащей глу-тамин, эмбриональную телячью сыворотку (10%) и антибиотики, в атмосфере CO2 (5%) при 37°C. Лимфоциты выделяли из цельной гепаринизиро-ванной крови здоровых доноров по стандартной методике [18]. Кровь наслаивали на смесь фикол-ла-урографина (р = 1.078 г/см3) и центрифугировали в течение 25 мин при комнатной температуре (1500 об/мин). Группирующиеся в интерфазном слое лимфоциты собирали и после двукратной отмывки в PBS суспендировали в этом же буфере. ^гласно морфологическому критерию, лимфоциты составляли не менее 90%.
Воздействия. В качестве метилирующего агента использовали метилнитрозомочевину (МНМ), которая была синтезирована в ИОХ РАН и в кристаллическом виде хранилась при -20°C. МНМ-обработку проводили через 24 ч после высева клеток. Препарат растворяли в питательной среде (250 мкМ) и немедленно добавляли к клеткам. Учитывая тот факт, что МНМ быстро распадается в растворе, клетки от агента не отмывали. Для подавления прямого деметилирования оснований в ДНК использовали О6-бензилгуанин (O6-bzG, "Sigma"), конкурентный ингибитор метилгуанин-ДНК-метилтрансферазы, который вносили в культуру за час до добавления МНМ. Гамма-облучение ^о60) лимфоцитов проводили при температуре +4°C. Для подавления репарации в суспензию вносили афидиколин ("Sigma") до концентрации 15 мкМ.
МТТ-показателъ жизнеспособности клеток. МТТ-тест проводили, согласно протоколу [www.RnDSystems.com/pdf/ta5355.pdf], в 96-луноч-ных планшетах. Деградацию МТТ-красителя 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразоли-ум бромида ("R&D Systems", CffiA) в формазан функционально активными митохондриями клеток прослеживали по оптической плотности против воздуха, которую регистрировали на 594 нм с помощью иммуноферментного планшетного фотометра ЭФОC 9305 (Россия). Каждая измеряемая точка - среднее из не менее трех повторов.
Оценка доли апоптотических клеток. Апо-птотический индекс определяли как частоту клеток с апоптотической морфологией ядра. Морфологические изменения прослеживали во флуоресцентном микроскопе после окрашивания
клеток смесью красителей акридинового оранжевого и бромистого этидия, руководствуясь протоколом фирмы "Merk Biosciences" (Calbiochem, Швейцария). К апоптотическим относили клетки, в которых хроматин был конденсирован в высокой степени, так что в нем не прослеживалась какая-либо структурная гетерогенность. Коллапси-рованный хроматин приобретал форму кольца, полумесяца, шара или виноградной грозди. Зеленая окраска свидетельствовала о целостности клеточных мембран. Клетки с проницаемой мембраной окрашивались в желтый или оранжевый цвет. Клетки с интактной структурой хроматина, окрашенные в желтый или оранжевый цвет, считали некротическими.
Метод ДНК-комет. Использовали нейтральный вариант метода [19]. Суспензию клеток в PBS (3-5 х 105/мл) смешивали с равным объемом 1.5%-ного раствора Low melting agarose, type IV ("Sigma"); смесь наносили на предметное стекло, которое ранее было покрыто тонким слоем 1%-ной агарозы, накрывали покровным стеклом и после застывания геля с иммобилизованными в нем клетками стекла погружали в сосуд, заполненный лизи
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.