МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2011, том 45, № 2, с. 335-345
MОЛЕKУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ
УДК 577.216.9
ЭФФЕКТИВНЫЙ И СПЕЦИФИЧНЫЙ КОНТРОЛЬ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА AML1/ETO В КЛЕТКАХ ОСTРОГО МИЕЛОИДНОГО ЛЕЙКОЗА С ПОМОЩЬЮ РНK-ИНTЕРФЕРЕНЦИИ, ОСНОВАННОЙ НА ЛЕНТИВИРУСНОЙ ТРАНСДУКЦИИ © 2011 г. В. В. Гринев1*, Д. В. Посредник1, O. Heidenreich2
1Кафедра генетики Биологического факультета Белорусского государственного университета, Минск, 220030,
Республика Беларусь
2Nothern Institute for Cancer Research at Newcastle University, Newcastle upon Tyne, NE2 4HH, UK
Поступила в редакцию 16.04.2010 г.
Принята к печати 02.09.2010 г.
Нами предложен и успешно апробирован метод контроля экспрессии гибридного гена amll/eto в клетках острого миелоидного лейкоза (ОМЛ), содержащих транслокацию t(8;21)(q22;q22). Разработанный подход основан на использовании методологии РНК-интерференции (РНКи) и лентивирусной трансдукции. Сконструировано и испытано два набора лентивирусных векторов доставки для запуска конститутивной анти-amll/eto РНК-интерференции в лейкозных клетках с помощью (1) искусственных микроРНК (тРНК) и (2) коротких шпилечных РНК ^РНК). Показано, что проведение трансдукции с использованием любого из этих наборов позволяет эффективно модифицировать лейкозные клетки линий Kasumi-1 и SKNO-1; при этом процент модифицированных клеток можно легко контролировать, манипулируя таким показателем как множественность инфекции (MOI). Так, при MOI 40 для клеток линии Kasumi-1 и MOI 20 для линии SKNO-1 содержание модифицированных клеток превышает 90%. При сравнительном анализе уровня нокдауна гена amll/eto с помощью конститутивной РНК-интерференции показано, что эффективность подавления экспрессии целевого гена в клетках Kasumi-1 и SKNO-1 выше при использовании вектора, несущего анти-amll/eto shРНK. Мы надеемся, что предлагаемый нами подход для контроля экспрессии гена amll/eto будет востребован при изучении функциональной значимости этого гена как в системах in vitro, так и in vivo.
Ключевые слова: ген amll/eto, РНК-интерференция, лентивирусная трансдукция, лейкозные клетки, нокдаун белка AML1/ETO.
EFFECTIVE AND SPECIFIC CONTROL OF AML1/ETO GENE EXPRESSION IN ACUTE MYELOID LEUKEMIA CELLS BY LENTIVECTOR-BASED RNA-INTERFERENCE, by V. V. Grinev1=*, D. V. Posrednik1, O. Heidenreich2 ^Department of Genetics, Faculty of Biology, Belarusian State University, Minsk, 220030 Republic of Belarus, *e-mail: grinev_vv@bsu.by; 2Nothern Institute for Cancer Research at Newcastle University, Newcastle upon Tyne, NE2 4HH, UK). In presented work, new approach for the control of aml1/eto gene expression in t(8;21)(q22;q22)-positive acute myeloid leukemia cells has been developed. The technique is based on using the RNA-interference and lentiviral transduction methodology. Two new lentiviral vector sets for induction of constitutive anti-aml1/eto RNA-interference in acute myeloid leukemia cells have been developed and tested. The first set was based on use of artificial microRNAs (miRNAs) and second one was intended for production of short hairpin RNAs (shRNAs). It was shown that Kasumi-1 and SKNO-1 leukemia cells can be efficiency transduced by each new lentiviral vector. Moreover, the percent of modified leukemia cells that may be easily evaluated in multiplicity of infection (MOI) test achieved more than 90% for Kasumi-1 and SKNO-1 cells at MOI 40 and 20, respectively. Comparative study elucidated that the anti-aml1/eto shRNA-based approach induced a stronger knock-down of aml1/eto gene in Kasumi-1 and SKNO-1 cells than the miRNA-based method did. We hope that the proposed approach may become useful instrument for controlling the aml1/eto gene expression in vitro as well as in vivo investigations of function and biological role of the gene.
Keywords: aml1/eto gene, RNA-interference, lentiviral transduction, leukemia cells, AML1/ETO protein knockdown.
Принятые сокращения: DsRedl (Discosoma red fluorescent protein 1) — красный флуоресцирущий белок; EGFP (enhanced green fluorescent protein) — усиленный зеленый флуоресцирующий белок; MOI (multiplicity of infection) — множественность инфекции; miPHK (microRNA) — микроРНК; shPHK (small hairpin RNA) — короткие шпилечные РНК; siPHK (small interfering RNA) — короткие интерферирующие РНК; ОМЛ — острый миелоидный лейкоз; РНКи — РНК-интерференция.
* Эл. почта: grinev_vv@bsu.by
ВВЕДЕНИЕ
Транслокация 1(8;21)(д22^22) между хромосомами 8 и 21 относится к наиболее распространенным генетическим нарушениям при остром миело-идном лейкозе (ОМЛ) [1]. В результате транслокации происходит объединение гена е?о, который локализован на хромосоме 8, с находящимся на 21-й хромосоме геном ат11 в единый гибридный ген ат\1/г1о на хромосоме 8 [2]. Этот ген кодирует гибридный белок AML1/ETO, который, по-видимому, и играет ключевую роль в инициации 1(8;21)(д22;д22)-положительной формы ОМЛ, блокируя нормальный ход гемопоэтической диф-ференцировки. Однако играет ли ген ат\1/г1о какую то роль в поддержании уже сформировавшегося ОМЛ, остается неизвестным. Эта неопределенность не позволяет рассматривать ген ат11/в1о, а также продукты его экспрессии (РНК или белок) как потенциальную мишень для разработки новых селективных ингибиторов в лечении ОМЛ.
В исследованиях, проведенных нами ранее, показано, что для изучения функциональной активности гена ат\1/г1о можно с успехом использовать РНК-интерференцию (РНКи) с помощью синтетических коротких интерферирующих РНК ^РНК), нацеленных на мРНК гена ат\1/г1о [3, 4]. Однако при такой стратегии не удается добиться полной элиминации белка AML1/ETO из лейкозных клеток; кроме того, подавление экспрессии гена ат\1/г1о носит кратковременный характер и, значит, неприемлемо при проведении длительных функциональных исследований этого гена (например, на животных).
Альтернативой вышеизложенной стратегии может стать следующая: использование ретро- или лентивирусных векторов для доставки в лейкозные клетки генов, кодирующих либо искусственные микроРНК (ш1РНК), либо короткие шпилечные РНК ^ИРНК). Принципиальная действенность такого подхода продемонстрирована в работе [5] на модели мышиной линии фибробластов SC1 с эктопической экспрессией гена атП/во. Однако авторы не учли ряд параметров, влияющих на эффективность и специфичность РНК. Так, для трансгеноза клеток линии SC1 использована кДНК только одного из 100 вариантов РНК гена ат11/в1о, которые образуются в лейкозных клетках [6, 7]; при этом не учтено соотношение уровня эктопической экспрессии гена ат\1/г1о с уровнем его реальной экспрессии в лейкозных клетках, что может влиять на эффективность РНКи. Кроме того, в представленной работе практически не уделено внимания анализу специфичности анти-ат/1/е?о РНКи. Наконец, при проведении функциональных исследований гена ат\1/г1о на моделях ксенотрансплантанта лейкоза более приемлемым вариантом считается не конститутивная, а индуцибельная РНКи с использованием индуцибельных Ро111-промоторов. А в рабо-
те [5] апробирован только вариант лентивирусных векторов, экспрессирующих shPHK под контролем PolIII-промоторов, эффективные индуцибельные версии которых в настоящее время находятся лишь на стадии разработок.
В связи с вышесказанным мы задались целью разработать и апробировать две лентивирусные векторные системы запуска конститутивной анти-amll/eto РНКи в клетках ОМЛ — с использованием miPHK и shPHK. При этом особое внимание уделено оценке не только эффективности, но и специфичности экспериментальной РНКи.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Клеточные линии. В работе использованы клетки линии HEK 293Т эмбриональной почки человека (DSMZ ACC 635), а также две клеточные линии ОМЛ человека - Kasumi-1 (ATCC CRL-2724™) и SKNO-1 (NIHS JCRB1170). Все три типа клеток культивировали по стандартной методологии.
Плазмидные и вирусные векторы. Плазмидный вектор оболочки pMD2.G, а также пакующий плазмидный вектор pCMV_dR8.91 предоставлены д-ром Д. Троно (D. Trono) из лаборатория вирусологии и генетики Политехнической школы г. Лозанна (Laboratory of Vrology and Genetics, École polytechnique fédérale de Lausanne, Швейцария). Лен-тивирусные векторы доставки pHR-SINcPPT-SEW и pHR-SINcPPT-SIEW получены из лаборатории д-ра М. Шерр (M. Scherr) отдела гематологии, гемостаза и онкологии Медицинской школы г. Ганновер (Department of Hematology, Hemostasis and Oncology, Medical School of Hannover, Германия). Челночный плазмидный вектор pDsRed1-C1 приобретен у фирмы "Clontech Laboratories Inc." (США). Новые бици-стронные лентивирусные векторы доставки pHR-CMV-DRep и pHR-CMV-DRep-amiAML1/ETO, а также моноцистронный вектор pHR-shAML1/ETO разработаны с использованием стандартных методов молекулярного клонирования. Перед получением вирусов векторы выделяли из бактерий Escherichia coli DH5a с помощью EndoFree® Plasmid Maxi Kit фирмы "QIAGEN" (Германия).
Получение рекомбинантных лентивирусов. Лен-тивирусы получали путем временной котрансфек-ции клеток линии HEK 293T плазмидным вектором оболочки, пакующим вектором и лентивирусным вектором доставки [8]. Сбор лентивирусов проводили через 72 ч после котрансфекции. Супернатант осветляли, используя методы низкоскоростного центрифугирования и фильтрации, после чего аликвоты замораживали и оставляли на хранение при -85°С. Функциональный EGFP-титр лентиви-русов в супернатанте определяли на клетках линии HEK 293T.
Рекомбинантные лентивирусы концентрировали методом ультрацентрифугирования (120000 g, 2 ч
при температуре +4°С; ультрацентрифуга Beckman Optima™ XL-100K, класс S).
Спинокуляция. К растущим в 6- или 12-луночном культуральном планшете ("SARSTEDT", Германия) клеткам добавляли содержащую лентивирусы среду в таком объеме, который необходим для достижения заданного значения множественности инфекции (MOI), а также Polybrene™ ("Sigma-Aldrich Co.", США) до конечной концентрации 8 мкг/мл. Планшет центрифугировали при температуре +32°С и ускорении 1500 g в течение 2 ч, после чего оставляли на ночь при 37°С во влажной атмосфере с 5% СО2. На следующий день культуральную среду заменяли на свежую, и далее клетки культивирова
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.