СЕНСОРНЫЕ СИСТЕМЫ, 2008, том 22, № 1, с. 52-59
СЛУХОВАЯ ^^^^^^^^^^
И ВЕСТИБУЛЯРНАЯ СИСТЕМЫ
УДК 612.858.3
ЭФФЕКТЫ ЭНДОГЕННОГО АНТИБИОТИКА ДЕФЕНСИНА NP-1 ЧЕЛОВЕКА НА СИНАПТИЧЕСКУЮ ПЕРЕДАЧУ В РЕЦЕПТОРАХ ВЕСТИБУЛЯРНОГО АППАРАТА
© 2008 г. Ю. Н. Андрианов, А. Д. Ноздрачев, И. В. Рыжова
Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН 199034 Санкт-Петербург, наб. Макарова, 6
E-mail: andryu@infran.ru Поступила в редакцию 04.06.2007 г.
Используя метод электрофизиологической регистрации импульсной активности целого нерва и внешнюю аппликацию веществ, исследовали механизмы действия нейтрофильного пептида дефен-сина NP-1 человека на синаптическую передачу в вестибулярных органах полукружных каналов лягушки. Аппликация дефенсина вызывала зависимое от дозы угнетение частоты импульсного разряда, при пороговой концентрации 1013 М. Совместная аппликация дефенсина и нейропередатчика L-глутамата вызывала снижение возбуждающих ответов, вызываемых L-глутаматом. Ингибирую-щее влияние дефенсина на ответы L-глутамата сохранялось в гипермагниевом растворе, в условиях изолированной активации постсинаптической мембраны. Ответы, вызываемые действием агони-стов L-глутамата АМПА, каината, НМДА и АЦПД, также были подвержены ингибирующему влиянию дефенсина. Амплитуда ответов при совместном действии ацетилхолина и дефенсина не отличалась от таковой, вызванной одним ацетилхолином. Аппликация атропина не оказывала влияния на ответы дефенсина и полностью ингибировала возбуждающее влияние ацетилхолина. Совместная аппликация дефенсина и налоксона ингибировала тормозное влияние дефенсина. Полученные данные продемонстрировали существование в афферентном синапсе вестибулярных органов клеточных механизмов, с помощью которых дефенсины могут контролировать афферентную активность и модулировать эффекты нейропередатчика L-глутамата.
Ключевые слова: глутаматные рецепторы, нейромедиаторы, нейромодуляторы, дефенсин, афферентный синапс, вестибулярный аппарат.
Дефенсины являются одной из основных групп низкомолекулярных эндогенных пептидов, являющихся важными компонентами врожденного и приобретенного иммунитета. Дефенсины изолированы из тканей многих живых организмов, включая, бактерии, грибы, растения, насекомых, птиц, ракообразных, амфибий и млекопитающих. Показано, что в местах микробного внедрения у различных видов животных отмечается повышенная концентрация а- и ß-дефенсинов. При этом а-дефенсины синтезируются нейтро-филами и выделяются в экстраклеточное пространство путем экзоцитоза. В свою очередь ß-дефенсины производятся эпителиальными клетками в местах проникновения инфекции в качестве ответа на микробные продукты, например, липополисахариды или провоспалительные цито-кины (Hancock, Diamond, 2000; Raj, Dentino, 2002; Boman, 2003; Schneider et al., 2005). Дефенсины демонстрируют высокие антибактериальные, анти-фунгальные и антивирусные свойства относительно широкого спектра микроорганизмов и являются эффекторными молекулами врожденного и приобретенного иммунитета. Дефенсины обнару-
жены в нейтрофилах крови, на мукозных и эпителиальных поверхностях тела, а также в кишечнике, легких, почках, коже. Индукция дефенсинов наблюдалась при развитии процесса воспаления, что может свидетельствовать о первичной роли дефенсинов в осуществлении защитной функции организма. Кроме этого, дефенсины инициируют и стимулируют развитие врожденного иммунного ответа, интегрируют его с приобретенным иммунным ответом и участвуют во многих других важных биологических процессах.
Значительный прогресс был достигнут в последние годы в исследовании локализации дефенсинов в живых организмах, их молекулярной и клеточной биологии, механизмов антимикробной и антивирусной активности дефенсинов и их фармацевтического использования (Hancock, Lehrer, 1998; Hancock, Diamond, 2000; Peschel, 2002; Schneider et al., 2005). В то же время, учитывая многообразную роль дефенсинов в живых системах, есть основания предполагать, что роль дефенсинов может быть более многообразной. В частности, весьма вероятно, что дефенсины могут оказывать влияние на мембранные рецепторы ней-
ронов и нервных волокон, модулировать их активность и ответные реакции нейрональных элементов. В этом отношении глутаматэргиче-ская синаптическая передача между волосковы-ми клетками и афферентными волокнами может представлять интерес как одно из возможных мест действия дефенсинов.
Действительно, предыдущие исследования показали, что связь вестибулярных волосковых клеток с афферентными волокнами не ограничивается хорошо известной синаптической передачей, и что нейромодуляторы могут модифицировать действие нейротрансмиттеров. Многие вещества, включая опиоидные пептиды (Guth et al., 1998a; Andrianov, Ryzhova, 1999; 2000; 2003; Lioudyno et al., 2000), аденозин, кальцитонин генрегулиру-ющий пептид, аденозинтрифосфат, таурин, ас-партат, гистамин, допамин, субстанция Р и другие (Bledsoe et al., 1988; Akoev, Andrianov, 1993; Guth et al., 1998a; Dememes, Ryzhova, 1997) были выдвинуты в качестве потенциальных кандидатов на роль нейромодуляторов. В процессе нейромоду-ляции в периферических вестибулярных органах могут, вероятно, участвовать и метаботропные глутаматные рецепторы (Guth et al., 1998b; Hen-dricson, Guth, 2002a, b; Andrianov et al., 2005).
Наши предыдущие исследования показали, что афферентный синапс периферических вестибулярных органов оказывается чрезвычайно чувствительным к внешней аппликации дефенсинов человека и кролика. При пороговых концентрациях 10-13 М оба вида дефенсинов активно ингиби-ровали синаптическую передачу и ответы на аппликацию эндогенного нейропередатчика L-глутамата. Было сделано предположение, что механизм действия дефенсинов может быть связан с модификацией глутаматных рецепторов афферентных си-наптических структур.
Настоящая работа является продолжением исследований механизма действия дефенсина на возбудимость периферической вестибулярной системы лягушки. Особое внимание уделялось роли глутаматных и опиатных рецепторов в механизме действия дефенсина.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
Эксперименты выполняли на лягушках Rana temporaria весом около 20 г. После декапитации животного проводили извлечение кости с мембранным лабиринтом. Изолированную слуховую капсулу, впоследствии называемую препарат, переносили в перфузионную камеру, обеспечивающую непрерывный проток раствором Рингера следующего состава: NaCl 95 мМ; КС1 1.7; NaHCO3 3.4; NaH2PO3 ■ 2H2O 0.5; СаС12 1.8; MgC12 0.6; глюкоза 2.5; рН 7.4. Раствор такого состава считали нормальным. В экспериментах по иссле-
дованию постсинаптического влияния веществ использовали гипермагниевый раствор, в котором 11.4 мМ NaCl и 1.8 мМ CaCl2 нормального раствора заменяли соответственно 3.0 мМ MgCl2 и 0.1 мМ СаС2.
В процессе эксперимента препарат непрерывно перфузировался раствором, содержащим или не содержащим исследуемые вещества, со скоростью около 1 мл/мин. Для анализа использовали следующие вещества: нейтрофильный дефенсин человека NP-1, (1S, 3R)-1-аминоциклопентан-íшяs-1,3-ди-карбоксиловая кислота (АЦПД), ^метил^-ас-партат (НМДА), каинат, D,L-альфа-амино-3-гид-рокси-5 -метил-4-изоксазолпропионовая кислота (АМПА), ацетилхолин иодид (АХ), атропин и на-локсон (все Sigma). Все вещества, кроме АЦПД, растворяли в нормальном растворе и, когда было необходимо, подводили рН до уровня 7.4. Применяли внешнюю аппликацию веществ, используя 6-канальный кран для переключения растворов.
Для регистрации множественной импульсной активности первичных афферентов, иннервиру-ющих полукружные каналы лягушки, использовали засасывающие стеклянные электроды с диаметром кончика 100-300 мкм в соответствие с диаметром нервных проводников. Кончик электрода позиционировали у конца афферентов полукружных каналов при помощи микроманипулятора и производили засасывание конца нерва внутрь элeктpoдa при пoмoщи шприца, соединенного с электродом гибким шлангом и заполненным нормальным раствором. Препарат использовали для эксперимента после завершения переходных процессов и стабилизации уровня импульсной активности в диапазоне 80-350 имп/с и не ранее 30 мин после завершения препаровки. Интервал между отдельными предъявлениями веществ составлял не менее 15 мин для отмывки предыдущего вещества и восстановления исходного уровня активности.
Импульсная активность непрерывно регистрировалась при помощи оригинальной программы в виде изменения частоты импульсации в течение эксперимента на экране монитора и сохранялась в текстовом формате на жестком диске компьютера. После завершения эксперимента импульсную активность анализировали путем построения графиков изменения частоты импульсации во времени при различных фармакологических воздействиях и проводили статистическую обработку результатов при помощи пакета программ MS Excel. Частоту импульсной активности определяли по 10-секундным интервалам соответствующих компьютерных данных. Эффекты дефенсина на кривых доза-ответ рассчитывали, определяя разницу значений частоты активности при достижении максимальной величины ответа и среднего значения импульсации за 1 мин предше-
Частота, имп/с
250
а
200 -
L-глутамат
150 А „„
100
50 1
0 500
Частота, %
Дефенсин
L-глутамат L-глутамат
Время, с
200 150 100 50
0
Фоновая активность
0.05 0.10 0.15 0.20 Концентрация L-глутамат, мМ
0.25
Частота, имп/с 500
400 -
Дефенсин L-глутамат TËnep-Mg2+
раствор
300 *
200 100
0
200 400 600 800 1000
1200 1400 Время, с
Рис. 1. Эффекты дефенсина NP-1 на возбуждающие ответы L-Глутамата. а - Оригинальная запись, демонстрирующая ингибирующее влияние 1 нМ дефенсина на ответы, вызванные действием 0.1 мМ L-Глутама-та. Прямые линии - отметка аппликации веществ. По оси абсцисс - время, с; по оси ординат-частота им-пульсации, имп/с (также на рис. 2-7). б - Кривые доза -ответ L-Глутамата 0.1 мМ (светлые символы) и L-Глутамата совместно с дефенсином (1 нМ) (темные символы). Каждая точка представлена средним значением и стандартной ошибкой.
ствующую аппликации вещества. Изменения частоты при совместном действии дефенсина и различных препаратов и частоту импульсации определяли
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.