НЕЙРОХИМИЯ, 2007, том 24, № 4, с. 304-311
= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
УДК 577.152
ЭФФЕКТЫ ИНГИБИТОРА КАСПАЗЫ-3 НА БИОХИМИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ АПОПТОЗА В ЗРЕЛОМ МОЗГЕ ПРИ ЕГО ЦЕНТРАЛЬНОМ ВВЕДЕНИИ
© 2007 г. В. В. Юрасов1*, М. А. Грудень1, 3. И. Сторожева1, Н. Е. Яковлева1, Е. В. Маркина1, В. И. Шаров2, В. В. Шерстнев1
1ГУ Институт нормальной физиологии им. П К. Анохина РАМН, Москва
2ГУ Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино, Московская
область
Проводили сравнительное исследование активности каспазы-3, эндогенного и экзогенного ингиби-рования стандартизованной in vitro активности каспазы-3 и межнуклеосомальной фрагментации ДНК в амигдале, гиппокампе и префронтальной коре мозга половозрелых крыс через 1 и 24 ч после интрацеребровентрикулярного введения ингибитора каспазы-3 N-Ac-DEVD-Al в дозе 10 мМ, вызывающей облегчение формирования долговременной памяти в модели условного замирания. В амигдале через 1 ч после введения ингибитор каспазы-3 инициировал выраженное снижение активности фермента и значимое усиление фрагментации ДНК через 1 ч и 24 ч. В гиппокампе активность каспазы-3 достоверно возрастала через 1 ч после введения N-Ac-DEVD-Al и сопровождалась увеличением количества фрагментов ДНК 200-3000 п. о. В префронтальной коре мозга изменений в активности и содержании исследуемых биохимических маркеров апоптоза не документировано. Предполагается, что полученные результаты свидетельствуют о сложной многоуровневой регуляции в мозге активности каспазы-3, которая участвует в сопряженных процессах нейрогенеза, апоптоза и нейропластичности.
Ключевые слова: апоптоз, каспаза-3, фрагментация ДНК, ингибитор каспазы-3, N-Ac-DEVD-Al, головной мозг, амигдала, гиппокамп, кора мозга.
ВВЕДЕНИЕ
Исследование процессов апоптоза (программируемой гибели клеток) в мозге взрослого организма является в настоящее время одной из наиболее актуальных задач нейробиологии. Однако если представления о значении нейроапоптоза в онтогенезе и при патологических состояниях (травматические повреждения нервной системы, церебральные инсульты, нейродегенеративные заболевания) в определенной степени сформировались [1], то изучение роли программированной клеточной гибели в процессах обучения и формирования памяти находится на этапе активного экспериментального поиска [2-5]. Исследования такого плана осложняются тем, что механизмы и факторы, вовлеченные в регуляцию апоптоза, могут принимать участие в других клеточно-мо-лекулярных событиях, протекающих в нервной ткани. Это в полной мере касается цистеиновых протеаз - каспаз, которые рассматриваются в качестве ключевого звена клеточной гибели по типу апоптоза и вместе с тем регулируют клеточ-
*Адресат для корреспонденции: 125009, г. Москва, ул. Моховая, д. 11, строение 4. Тел.: (495) 6012130, e-mail: vyurasov@rambler.ru
ный цикл, пролиферацию и дифференцировку, а также пластические перестройки клеток мозга [6, 7]. Одним из инструментов экспериментального изучения указанных вопросов являются ингибиторы каспаз [8]. В ряде работ исследовано влияние ингибиторов каспазной активности на обучение, поведение и память в условиях внутримозгового введения [9-12]. Однако результаты проведенных работ противоречивы, а их трактовка неоднозначна. Остается неясным, связано ли действие ингибиторов с изменениями "неапоптозных" функций каспаз, в частности, свойств нейропластичности, или ингибиторы каспаз оказывают влияние на уровень фрагментации ДНК и тем самым, согласно "классическим" представлениям об апоптозе, предполагают прямую зависимость степени фрагментации хроматина от активности каспаз. Сложившаяся ситуация в определенной степени связана с тем, что в ранее выполненных исследованиях с внутримозговым введением ингибиторов каспаз, как правило, не проводили определения активности фермента и не оценивали межнукле-осомальную фрагментацию ДНК - признак терминальной стадии апоптоза [13]. Учитывая изложенное, целью данной работы было определение
биохимических маркеров апоптоза - активности каспазы-3 и фрагментации ДНК в амигдале, гип-покампе и префронтальной коре мозга у половозрелых крыс после внутрижелудочкового введения специфического ингибитора каспазы-3.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Эксперименты проведены на крысах-самцах линии Wistar 3-месячного возраста и массой 200220 г. Животных содержали по 4 особи в клетках со свободным доступом к воде и пище, при постоянной комнатной температуре +22°С и регулярном световом цикле (включение света в 8 : 00, выключение в 22 : 00). Время проведения опытов с 11 : 00 до 15 : 00. Ингибитор каспазы-3 обратимого действия - N-Ac-DEVD-Al (Sigma, США) - в дозе 10 мМ, в объеме 2 мкл физиологического раствора вводили в желудочки мозга крыс (n = 12) через предварительно вживленные канюли. В качестве "контроля" использовали животных (n = 12), которым интрацеребровентрикулярно вводили физиологический раствор. Спустя 1 и 24 ч после введения исследуемых веществ у крыс при +4°С выделяли структуры мозга: амигдалу, гип-покамп и префронтальную кору.
Структуры головного мозга крыс выделяли и гомогенизировали в охлажденном лизирующем буфере (150 мМ NaCl, 50 мМ Tris, 5 мМ CHAPS, 5 мМ Дитиотриетол, 20 мМ ЭДТА, pH 7.5) в соотношении ткань-буфер 1 : 10 (~10 мг белка на 1 мл супернатанта) на гомогенизаторе Heidolph DIAX 100 (Германия) при 5000 об/мин, 15 с. Гомогенаты центрифугировали (+4°С, 25000g, 30 мин) на центрифуге Hettich Micro 220R (Германия). Суперна-танты разделяли на аликвоты и использовали для определения активности каспазы-3, а также эндогенного и экзогенного ингибирования стандартизованной in vitro активности каспазы-3. Оставшуюся часть гомогената для экстракции ДНК, в том числе из "ранних" везикул, диспергировали (5 мин, 900 колебаний/с) на вортексе vT-32 (Biosan, Латвия) в долизирующем буфере составом (конечн. конц.): 150 мМ NaCl, 50 мМ Tris, 5 мМ CHAPS, 5 мМ дитиотриетола, 20 мМ ЭДТА, 5% ПЭГ, 2% нонидета NP-40 и 1% дезоксихолата натрия, рН 8.0 и центрифугировали (+4°С, 8000g, 20 мин). Су-пернатант использовали для выделения очищенной фракции фрагментированной ДНК [14].
Активность каспазы-3 определяли, инкубируя (+37°С, 3 ч) аликвоты супернатантов (~300 мкг белка) в аналитическом буфере (20 мМ HEPES, 5 мМ Дитиотриетол, 2 мМ ЭДТА, 5 мМ CHAPS, pH 7.5) с 200 мкМ субстрата каспазы-3 ацетил-Asp-Glu-Val-Asp-р-нитроанилида (Ac-DEVD-p-ni-troanilide) (Sigma, США). Высвобождение в реакционную среду p-нитроанилина оценивали через каждые 30 мин в 96-луночных плоскодонных по-листирольных планшетах на фотометре Униплан
(Пикон, Россия) при 405 нм [15]. Активность каспазы-3 рассчитывали по скорости высвобождения р-нитроанилина в пмоль/мин в пересчете на 1 мг белка. Концентрацию белка измеряли в соответствующих определению активности фермента аликвотах супернатанта, в присутствие пи-рогаллолового красного и молибдата натрия по образованию цветного продукта реакции спек-трофотометрически при 600 нм с использованием наборов (Biocon, Германия).
Для подтверждения специфичности гидролиза ацетил-Asp-Glu-Val-Asp-p-нитроанилида каспазой-3 аликвоты супернатанта дополнительно инкубировали в присутствии 20 мкМ ингибитора каспазы-3 Ac-DEVD-Al (Sigma, США) в тех же условиях, что и пробы, содержавшие только субстрат. В качестве отрицательных "холостых проб" отдельно инкубировали субстрат каспазы-3 и субстрат каспазы-3 совместно с ингибитором фермента в тех же условиях, что и опытные пробы.
Для определения в гомогенатах (~30 мкг белка) эндогенных и экзогенных ингибиторов применяли оригинальную модельную систему в условиях in vitro: образцы аликвот инкубировали в присутствии 100 мкМ субстрата каспазы-3 ацетил-Asp-Glu-Val-Asp-р-нитроанилида (Ac-DEVD-p-nitroanil-ide) (Sigma, США) и 1 мкл коммерческого препарата каспазы 3 со стандартизованной активностью (1.0 Ед/мг белка), (Sigma, США) в аналитическом буфере (350 мкл, +37°С, 8 ч). Высвобождение в реакционную среду р-нитроанилина оценивали через 30 мин в 96-луночных плоскодонных полисти-рольных планшетах на фотометре Униплан (Пикон, Россия) при 405 нм. Ингибирование активности каспазы-3 рассчитывали по скорости высвобождения р-нитроанилина в пмоль/мин в пересчете на 1 мг белка, а данные представляли в процентах от активности фермента в модельной системе, принятой за 100%.
Межнуклеосомальную фрагментацию ДНК выявляли методом горизонтального электрофореза в агарозном геле с прокрашиванием ДНК SYBR Green I [16]. Гидролиз белков в супернатан-те проводили по разработанному оригинальному протоку в течение 15 ч при +56°С в присутствии 1%-ного раствора додецилсульфата натрия и про-теиназы К (2.5 мкг/мкл). РНК гидролизовали в присутствие 5 мкг/мкл РНКазы в течение 1 ч при +37°С. ДНК осаждали (-20°С, 40 мин) добавлением к пробе 10 М ацетата аммония и 96%-ного этилового спирта (0.5 и 2.5 по объему, соответственно) и центрифугировали (+4°С, 30000 g, 20 мин). Полученный осадок дважды диспергировали по 10 мин в 10 объемах 80%-ного этилового спирта на вортексе VT-32 (Biosan, Латвия) с последующим переосаждением (-20°С, 40 мин) и центрифугированием (+4°С, 25000 g, 15 мин). Осажденную ДНК лиофилизировали и перерастворяли в ТЭ-
306
ÛPACOB и др.
Таблица 1. Активность каспазы-3 (пмоль/мин/мг белка) в исследованных отделах мозга крыс (М ± 8.Е.М)
Группа Отделы мозга
животных гиппокамп амигдала кора
Контрольные 8.31 ± 1.51 9.74 ± 1.74 4.71 ± 0.49*
1ч носле введения 12.48 ± 0.91** б.37 ± 1.10** 5.31 ± 0.35
24 ч после введения 10.03 ± 1.14 11.27 ± 1.28 4.7б ± 0.92
Примечание: * р < 0.05 - достоверность различий в сравнении с гиппокампом и амигдалой внутри группы контрольных животных (ANOVA).
** р < 0.05 - достоверность различий по сравнению со значениями у "контрольных" животных (ANOVA).
буфере (10 мM Tris и 0.1 мM ЭДТА, pH 7.4) таким образом, чтобы концентрация ДНК находилась в диапазоне 0.5-1.0 мкг ДНК на 1 мкл буфера. Концентрацию ДНК определяли спектрофотометри-чески при 2б0 нм. Электрофорез ДНК проводили в 2%-ном агарозном геле с использованием горизонтальной камеры SE-2 (Хеликон, Россия). ДНК в ТЭ буфере смешивали с загрузочным буфером (ТБЭ
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.