ЭФФЕКТЫ В-ЭНДОРФИНА И [D-ALA2,N-ME-PHE4,GLY5-OL]-ЭНКЕФАЛИНА НА ПРОЛИФЕРАТИВНУЮ АКТИВНОСТЬ ЛИМФОЦИТОВ В УСЛОВИЯХ БЛОКАДЫ ОПИАТНЫХ РЕЦЕПТОРОВ IN VITRO

БАЕВА Т.А.; ГЕЙН С.В.; ЧЕРЕШНЕВ В.А.

ОРИГИНАЛЬНАЯ СТАТЬЯ

ЭФФЕКТЫ ß-ЭНДОРФИНА И [D-ALA2,N-ME-PHE4,GLY5-OL|-ЭНКЕФАЛИНА НА ПРОЛИФЕРАТИВНУЮ АКТИВНОСТЬ ЛИМФОЦИТОВ В УСЛОВИЯХ БЛОКАДЫ ОПИАТНЫХ

РЕЦЕПТОРОВ IN VITRO

Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермский Государственный Университет, Пермь, Россия; Институт иммунологии и физиологии УРО РАН, Екатеринбург, Россия

Поступила: 20.02.06 г. Принята: 04.09.07 г.

В системе in vitro изучено влияние ß-эндорфина и [й-Л1а2,К-Ме-РИе4,С1у5-о1]-энкефа-лина (DAGO) в условиях блокады опиатных рецепторов налоксоном гидрохлоридом на пролиферативный ответ лимфоцитов, индуцированный ФГА. Установлено, что как ß-эндорфин, так и DAGO в системе in vitro оказывали стимулирующее влияние на функциональную активность лимфоцитов. Их эффект не блокировался налоксоном, но блокировался налтриндолом. При оценке вклада факторов в регуляцию пролифера-тивного ответа было установлено, что ß-эндорфин, DAGO и налоксон оказывают самостоятельное, не зависящее друг от друга стимулирующее влияние на пролифератив-ную активность лимфоцитов периферической крови преимущественно в условиях низкой митогенной стимуляции.

Ключевые слова: опиоидные пептиды, пролиферация, опиатные рецепторы, налоксон

ВВЕДЕНИЕ

Эндогенные и синтетические опиоидные пептиды являются одними из важнейших факторов регуляции процессов адаптации [1], в реализации которых иммунной системе отводится одна из основных ролей [2, 3]. Несмотря на то, что изучению влияния опиоидных пептидов на иммунную систему в литературе уделено достаточно много внимания [3, 4, 5, 6, 7], вопрос о механизмах реализации эффектов, в частности, Р-эндорфина, способного действовать через несколько типов опиатных рецепторов, и пептидных агонистов ц-опиат-ных рецепторов остается актуальным. Известно, что эффекты, реализуемые при стимуляции различных типов опиатных рецепторов могут носить прямо противоположный характер [4, 6], кроме этого рядом авторов показана независимость влияния Р-эндорфина на пролиферативный ответ лимфоцитов от блокады опиатных рецепторов [6, 8, 9]. Цель работы — оценка в системе in vitro силы и характера влияния Р-эндорфина, а также селек-

тивного ц-лиганда DAGO в условиях блокады опиатных рецепторов на пролиферативный ответ лимфоцитов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Лейкоциты периферической крови десяти здоровых мужчин-добровольцев в возрасте от 22 до 30 лет культивировали с фито-гемагглютинином Р (ФГА «Sigma» 2,5, 5, 10 мкг/мл) в 96-луночных круглодонных планшетах. Каждая культура содержала 2 х 105 клеток в 0,2 мл полной питательной среды, которую готовили на основе среды 199 с добавлением 10 mM HEPES («Sigma»), 2 mM L-глутамина («Sigma»), 100 мкг/мл гентамицина и 10% ЭТС («Биолот», Санкт-Петербург). Культивирование осуществляли во влажной атмосфере с 5% СО2 при 37°С в течение 72 часов. За 18 часов до окончания культивирования в каждую лунку вносили по 2 мкКи 3Н-метилтимидина («Изотоп», Санкт-Петербург) в объеме 10 мкл. Содержимое каждой лунки последовательно осаждали на фильтры Synpor с диаметром пор 0,45 мкм при давлении вакуумного насоса 0,5—1,0 атм., промывая каж-

Адрес: 614081 Пермь, ул. Голева, 13, Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН. E-mail: gein@iegm.ru

дую лунку 0,85% раствором хлорида натрия не менее 4 — 5 раз. Фильтры промывали для удаления несвязавшегося тимидина 5 мл 0,85% NaCl, 5 мл охлажденной до 4°С 5% трихлоруксусной кислоты и 5 мл 0,85% NaCl. Радиоактивность проб определяли на жидкостном сцинтилляционном счетчике «Guardian» (Wallac, Финляндия). ß-эндор-фин («Sigma») использовали в концентрациях 10-7 М, [d-Ala2,N-Me-Phe4,Gly5-ol]-эн-кефалин (DAGO) («Sigma») — 10-8 М, нало-ксона гидрохлорид («DuPont», США) — 10—6, 10-8, 10-10 М, налтриндола гидрохлорид 10—6 М. Выбор концентрации ß-эндорфина и DAGO основывался на исследованиях, проведенных ранее [10].

Статистический анализ результатов проводили с помощью многофакторного дисперсионного анализа для парных данных и, следующего за ним, t-критерия Стьюдента для парных данных. В качестве факторов рассматривались опиоидные пептиды, налоксона гидрохлорид и ФГА.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Оценка суммарного влияния факторов в культурах с Р-эндорфином показала наличие у митогена (Ё = 52,33; Р < 0,0001), Р-эндорфи-на (Ё = 5,74; Р < 0,04) и налоксона (Ё = 3,3; Р < 0,035) самостоятельных эффектов на выраженность РБТЛ.

Как видно из рис. 1, в присутствии ФГА 2,5 мкг/мл Р-эндорфин в концентрации 10-7 М статистически значимо усиливал про-лиферативный ответ по сравнению с контролем. В культурах с Р-эндорфином на фоне блокады опиатных рецепторов наблюдалось усиление пролиферации как по сравнению с контролем, так и по сравнению с изолированным эффектом Р-эндорфина. Этот феномен имел место при всех используемых нами концентрациях налоксона. Неожиданным оказалось наличие у налоксона самостоятельного стимулирующего эффекта на пролифератив-ный ответ в концентрациях 10-6, 10-8, 10-10М по сравнению с контролем. В присутствии

О 20000 40000 60000 80000100000

в

контроль р-эф

ß-эф+нг 10"6 м ß-эф+нг Ю-8 м ß-эф+нг Ю"10 м нг КГ6 м нг 10-8 м

контроль

Р-эф

ß-эф+нг 10"6 м ß-эф+нг Ю-8 м ß-эф+нг Ю"10 м нг КГ6 м нг 10-8 м нг Ю"10 м

50000 100000 150000 Г

50000 100000 150000

2000

Рис. 1. Влияние Р-эндорфина (Р-эф) в условиях блокады опиатных рецепторов налоксоном гидрохлоридом (НГ) на пролиферативный ответ лимфоцитов в присутствии ФГА 2,5 мкг/мл (А), 5 мкг/мл (Б), 10 мкг/мл (В) и в культурах без ФГА (Г). По оси абсцисс: интенсивность пролиферации (имп/мин). Здесь и на рис. 2: *р < 0,05 по сравнению с контролем; *р < 0,05 по сравнению с Р-эндорфином.

контроль

ß-ЭНД

ß-энд+нт КГ6 M

HT КГ6 M

н #

100000 200000 300000 400000 имп/мин

Рис. 2. Влияние DAGO в условиях блокады опиатных рецепторов на пролиферативный ответ лимфоцитов в культурах без ФГА (А), в присутствии ФГА 2,5 мкг/мл (Б), 5 мкг/мл (В) и 10 мкг/мл (Г). По оси абсцисс: К — контроль, 1 - DAGO, 2 - DAGO + налоксон 10-6 М, 3 - налоксон 10-6 М. По оси ординат: интенсивность пролиферации (имп/мин).

контроль

DAGO

DAGO+HT

-1-

100000

~г

200000 300000 имп/мин

-1

400000

Рис. 3. Влияние ß-эндорфина (А) и DAGO (Б) на пролиферативный ответ лимфоцитов в культурах с ФГА 2,5 мкг/мл в условиях блокады 5-опиат-ных рецепторов налтриндолом гидрохлоридом 10-6 М (НТ). По оси абсцисс: интенсивность пролиферации (имп/мин). *р < 0,05 по сравнению с контролем.

ФГА 5 мкг/мл статистически достоверный стимулирующий эффект отмечался только при комбинации ß-эндорфина с налоксоном, а также на фоне налоксона в концентрации 10-6 М. На фоне концентрации митогена 10 мкг/мл и в культурах без митогена статистически значимых эффектов исследуемых соединений выявлено не было. Таким образом, на фоне блокады опиатных рецепторов налоксоном в присутствии ß-эндорфина наблюдалось не снижение, а, напротив, повышение интенсивности пролиферации, связанное с самостоятельным стимулирующим эффектом налоксона.

д-агонист DAGO оказывал статистически значимый эффект на пролиферацию только в присутствии ФГА 2,5 мкг/мл (F = 7,02; P < 0,05). Налоксон достоверно влиял на пролиферативный ответ в присутствии ФГА 2,5 (F = 21,67; P< < 0,002) и 5 мкг/мл (F = 16,27; P < 0,005).

Данные о влиянии DAGO в условиях блокады опиатных рецепторов на выраженность РБТЛ представлены на рис. 2. На спонтанную

пролиферацию ни пептид, ни его комбинация с налоксоном влияния не оказывали. В культурах с ФГА 2,5 мкг/мл DAGO оказывал стимулирующий эффект на пролиферативный ответ по сравнению с контролем. Как и в случае с ß-эндорфином, на фоне блокады опиат-ных рецепторов наблюдалось усиление про-лиферативной активности как по сравнению с контролем, так и по сравнению с изолированным внесением в культуры DAGO. Налоксон в присутствии ФГА 2,5 мкг/мл стимулировал пролиферативную активность по сравнению с контрольными значениями. На фоне ФГА 5 мкг/мл пептид на пролиферативный ответ не влиял. Стимулирующий эффект на РБТЛ был выявлен при комбинации пептида с налоксоном и при внесении в культуры одного налоксона. В культурах с ФГА 10 мкг/мл никаких статистически значимых эффектов DAGO выявлено не было. Таким образом, селективный агонист д-рецепторов оказывал эффект схожий по своему характеру с эффек-

том ß-эндорфина, но выраженный несколько слабее.

Принимая во внимание, что налоксон является неселективным антагонистом, а ß-эндор-фин способен взаимодействовать как с ц-, так и с 5-рецептором, мы проанализировали эффекты исследуемых пептидов на фоне блокады 5-рецепторов. Учитывая, что эффект опио-идов на пролиферацию проявлялся преимущественно в культурах с субоптимальной концентрацией ФГА, вклад 5-рецепторов в эффекты ß-эндорфина и DAGO оценивали в культурах, стимулированных ФГА 2,5 мкг/мл. При анализе влияния ß-эндорфина и селективного ц-агониста DAGO на фоне блокады 5-рецепторов налтриндолом гидрохлоридом были получены следующие результаты (рис. 3). Блокада 5-рецепторов отменяла стимулирующие эффекты ß-эндорфина и DAGO на пролиферативный ответ, при этом в отличие от налоксона 5-антагонист налтриндол на пролиферативный ответ не влиял.

ОБСУЖДЕНИЕ

Как было показано ранее, на выраженность пролиферативного ответа лимфоцитов ß-эндорфин может оказывать как стимулирующее, так и угнетающее влияние [4, 8, 10, 11, 12], направленность которого в модели in vitro зависит от состава клеточной фракции, а именно от присутствия моноцитов в культуре [13]. ß-эндорфин способен оказывать как прямые, через стимуляцию опиоидных (ц-, 5-) и неопиоидных (не блокируемых налоксо-ном) рецепторов, так и опосредованные эффекты. Последние могут включать в себя активацию синтеза отдельных цитокинов ИЛ-1, ИЛ-4, ИЛ-2 [14, 15, 16], возможность взаимодействия с рецептором к ИЛ-2 [17, 18], распад пептида на отдельные фрагменты, каждый из которых может обладать собственной иммуномодулирующей активностью [19]. Наиболее выраженное действие ß-эндорфи-на и DAGO проявляется преимущественно в присутствии субоптимальных концентраций митогена [4, 10].

Оценка зависимости влияния ß-эндорфина от блокады опиатных рецепторов показала отсу

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.