БИОФИЗИКА, 2009, том 54, вып.3, c.459-463
== БИОФИЗИКА КЛЕТКИ= =
УДК 577.352.3
ЭКСПЕР ИМЕНТАЛЬНАЯ П P ОВЕРКА МОДЕЛИ КОМПЛЕМЕНТЗАВИСИМОГО ИММУННОГО ЛИЗИСА ЛИПОСОМ
© 2009 г. С.П. Ярков, С.Н. Скопинская
Государственный научный центр - Государственный научно-исследовательский институт биологического приборостроения, 125424, Москва, Волоколамское шоссе, 75, к. 1 E-mail: пиЪр@йо1.гы Поступила в p едакцию 22.01.08 г. После доработки 14.04.08 г.
И сследованы количественные зависимости величин комплементзависимого иммунного лизиса монодисперсной суспензии липосом диаметром 200 нм, мембраны котор ы x сенсибилизир ованы одновалентным гаптеном (2,4-ДНФ-е-капроил-ДПФЭ), или поливалентным антигеном (липо-полисахариды из Frandsella tularensis), от начальной концентрации специфических антител (IgG). Оценено количество антигенных валентностей на внешней поверхности единичной липосомы, взаимодействующих с антителами. Показано различие между величинами комплементзависимого иммунного лизиса поли- и монодисперсной суспензий липосом. Экспериментальные р езультаты удовлетвор ительно описываются моделью прямого связывания.
Ключевые слова: липосомы, комплементзависимый иммунный лизис, модель прямого связывания.
Эффект повр еждения мембран липосом при образовании на их поверхности комплексов антиген-антитело (АГ-АТ), и последующая активация этими комплексами комплемента лежит в основе плодотворно развивающегося метода -липосомного комплементзависимого иммуноа-нализа, позволяющего с высокой чувствительностью выявлять низкомолекулярные гаптены, пестициды, антигены патогенных бактерий, о су-ществлять серодиагностику заболеваний [1-3].
Комплементзависимый лизис липосом, в мембраны которых искусственно встроены антигены, в присутствии специфических антител включает несколько стадий. Сначала антитела реагируют с находящимися на поверхности ли-посом молекулами антигенов с образованием комплекса(-ов) антиген-антитело. Затем антитела в составе иммунных комплексов связывают первый компонент системы комплемента, белок С^, что инициирует каскад ферментативных реакций, завершающийся образованием комплекса, атакующего мембрану, со стехиометр и-ческой формулой (С5Ъ-8)1С96 и молекулярной массой = 1000 кДа [4], обеспечивающего появление трансмембранного канала, позволяющего осуществлять быстрый массообмен между внутренним объемом липосом и внешней средой.
Сокращения: АГ - антиген, АТ - антитело, ЛПС - ли-полполисахарид, 2,4-ДНФ-е-кап-ДПФЭ - 2,4-ДНФ-е-ка-проил-дипаль мито илфо сатидилэтано ламин.
Изменения динамики липидов мембран липосом при комплементзависимом иммунном лизисе были также показаны методом спинового зонда [5].
Теоретическая модель лизиса липосом, названная авторами моделью пр ямого связывания (dired binding model), о снована на ра ссмотрении кинетики множественных равновесий при образовании комплексов АГ-АТ на поверхности липосом [6,7]. Целью настоящей работы была экспериментальная проверка отдельных положений этой теории иммунного комплементзависимого лизиса липосом. В качестве объектов исследования были выбраны однослойные ли-посомы, в мембрану которых встраивали одновалентный гаптен и поливалентный бактериальный антиген липополисахаридной (ЛПС) природы.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В качестве модели липосом, содержащих одновалентный гаптен, использовали липосомы следующего состава: яичный лецитин : холе-стер ин : дицетилфосфат : 2,4-ДНФ-е-капроил -дипальмитоилфосатидилэтаноламин в мольном соотношении 2,0:1,5:0,22:0,02, содержащие во внутреннем объеме 100 мМ сульфородамина 101. Источником антител служила аффинноочи-щенная фр акция IgG против 2,4-ДНФ-е-амино-капроновой кислоты (Sigma).
460
ЯРКОВ, СКОПИНСКАЯ
Моделью липосом, содержащих поливалентный бактериальный антиген, служили липосо-мы состава: яичный лецитин : холестерин : дицетилфосфат (все липиды Sigma), в мольном соотношении 2,0:1,5:0,22, мембрана которых содержала ЛПС бактерий Francisella tularensis. Концентрация маркера кальцеина во внутреннем объеме составляла 150 мМ. Источником антител были моноклональные антитела FB11X. ЛПС и антитела были получены из ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии Роспотребнадзор а. Для лизиса использовали препараты комплемента кролика производства «Иммунопрепарат» (Россия).
О величине иммунного лизиса A мембран липосом судили по флуоресценции сульфоро-дамина 101 или кальцеина, вытекающих во внешнюю среду из внутреннего объема липо-сом, через трансмембранные каналы, образованные в результате иммунной реакции. За 100%-й лизис липосом принимали флуоресценцию образца, при полном разрушении липо-сомной суспензии 1%-м ра створ ом тритона X-100.
Получение липосом методом обращения фаз, постановка реакции комплементзависимо-го иммунного лизиса липосом, расчет величины иммунного лизиса липосомной суспензии в присутствии антител и комплемента с использованием измеренных значений флуоресценции подробно описаны ранее [8,9]. Концентрацию антигена в мембранах липосом регулир овали при формировании липосомной суспензии. С целью получения гомогенной по размерам суспензии липосомы многократно экструдировали через фильтры Кис1еорог с диаметром пор 200 нм.
Аппроксимацию экспериментальных точек при анализе зависимостей иммунного лизиса липосом от начальной концентрации антител проводили методом нелинейной регрессии Мар-квардта.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Авторы модели прямого связывания [6,7] предложили зависимость,
f = (ni)([Ab0]/Р)'(1 + [Ab°]/P)-n, (1)
где в = K—f + n[V0], позволяющую рассчитать долю липосом f, которая несет на своей поверхности i присоединившихся антител, от начальных молярных концентраций антител и ли-посом в реакционной смеси [Ab0], [V0 ]. В выражении (1) Keff - эффективная константа связывания антител и антигенов на поверхности липосом, учитывающая стерические эффекты
пр и взаимодействии липосом, поверхность которых несет антиген с антителами и валентность антител; п - количество антигенных валентностей на поверхности единичной липосомы; (п-1) -число комбинаций количества антигенных валентностей и количества присоединенных антител на поверхности единичной липосомы. Указанное соотношение действует в условиях ряда ограничений: липосомы сферичны, суспензия липосом монодисперсна, антитела имеют узкое распределение по константам связывания; п >> г, т.е. количество антигенных валентностей на мембране во много раз превышает число пр исоединившихся антител. Функция (1) имеет вид колоколообразной кривой с максимумом, смещающимся в сторону больших концентраций антител при увеличении г, причем доля липосом с числом присоединенных антител г более двух относительно невелика.
И сходя из вышеизложенного, величина наблюдаемого в экспер именте иммунного лизиса А монодисперсного препарата липосом может быть выражена как:
А = а/ + / + /4 + / + .... + /) = а/2, (2)
где 0 < а < 1,0 - величина, отражающая эффективность активации мембранными комплексами АГ-АТ системы комплемента и последующего лизиса с образованием трансмембранных каналов.
Экспериментальная проверка справедливости выражения (2) была проведена нами на примере монодисперсной суспензии липосом диаметром 200 нм, поверхность которых была сенсибилизирована одновалентным гаптеном. Для этой цели выбрали липосомы, сенсибилизированные конъюгатом К-2,4-динитрофенил-е-аминокапроновой кислоты и дипальмитоилфос-фатидилэтаноламина (2,4-ДН Ф -е-кап-ДПФЭ).
Величину п задавали путем введения в реакционную смесь для формирования липосом различных концентраций 2,4-ДНФ-е-кап-ДПФЭ (таблица). Концентрацию липосом вычисляли исходя из того, что количество молекул липида, содержащегося в одной липосоме диаметром 200 нм, равно 3,57-105 молекул [10], и предполагая, что численные пар аметры упаковки молекул в бислое такие же, как у липосом, состоящих из чистого яичного лецитина. Полагали также, что гаптен (2,4-ДНФ-е-кап-ДПФЭ) равномерно распределен между внешней и внутренней сторонами липидного бислоя.
Экспериментальные кривые зависимости иммунного лизиса липосом от начальной концентрации антител в реакционной смеси имели
ЭК СПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ П Р ОВЕРКА МОДЕЛИ
461
Сравнение количества антигенных валентностей гаптена и высокомолекулярного антигена, сенсибилизирующих внешнюю мембр ану липосом, р а ссчитанных на стадии фо р мир ования липосом и опр еделенны х по формуле (2) из экспериментальных кривых комплементзависимого иммунного лизиса
Липополисахар идный антиген Г. гиХатвтгз. Антитела - моноклональные антитела ББ11Х
П р имечание. * Весовая концентрация ЛПС -антигена пр и фор мир овании липосом со ставила 100 мкг/мкмоль сумма р ного
Число антигенных валентностей п на внешней поверхности единичной липосомы, реагирующих с антителами
рассчитанное при формировании липосом
р езультаты аппр оксима-ции методом Мар квар д-
та пр и г = 2, а = 1,0 экспер иментальных кр и -вых пр и 95% довер и-тельной вероятности
Гаптен 2,4-ДНФ-е-капроил-ДПФЭ. Антитела - аффинноочищенная фракция
Липополисахаридный антиген Г. гиХатвтгз. Антитела - моноклональные антитела ББ11Х
П р имечание. * Весовая концентр ация ЛПС-антигена пр и фор мир овании липосом со ставила 100 мкг/мкмоль суммар ного липида.
колоколообразный вид с выраженным плато, величина максимума кр ивой зависела от концентр ации гаптена, сенсибилизирующего поверхность липосом. Экспер иментально наблюдаемые величины иммунного лизиса липосом А изменялись в пределах от 0 до 0,5 (0-50%). Очевидно, что кривые комплементзависимого иммунного лизиса полидисперсной суспензии липосом должны отличаться от таковых для монодисперсной суспензии. Эти отличия должны возникать из-за изменения эффективности лизиса системой комплемента липосом разных р азмер ов, так как различны вер оятности обр а -зования близкорасположенных пар антител, способных активировать комплемент по прямому пути [11]. Действительно, кривые комплементзависимого иммунного лизиса липо сом, пр оведенного с одной и той же пар тией антител и комплемента, р азличаются для монодисперсной и полидисперсной суспензий липо сом с одинаковым содержанием антиг
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.