БИОФИЗИКА, 2009, том 54, вып.2, c.252-255
= БИОФИЗИКА КЛЕТКИ
УДК 612.112.94:[615.281+615.8314]
ЭКСПРЕССИЯ СБ3-КОМПЛЕКСОВ НАТИВНЫМИ И УФ-ОБЛУЧЕННЫМИ Т-ЛИМФОЦИТАМИ КР ОВИ ЧЕЛОВЕКА ПОСЛЕ ИХ МОДИФИКАЦИИ ПРЕПАРАТОМ ЛЕЙКОЦИТАРНОГО
а-ИНТЕР ФЕР ОНА
© 2009 г. В.Г. Артюх ов, О.В. Путинцева, И .А. Колтаков, В.А. Вдовина
Воронежский государственный университет, 394006, Воронеж, Университетская пл., 1
E-mail: avg@main.vsu.ru Поступила в p едакцию 29.09.06 г. После доработки 14.01.08 г.
Изучено влияние лейкоцитарного а-интер фер она в концентрациях 0,01; 0,1; 1; 10 и 100 МЕ/мл на экспрессию СБ3-комплексов нативными и фотомодифицированными Т-лимфоцитами крови человека. Установлено, что облучение суспензий Т -клеток УФ-светом в дозах 151-906 Дж/м увеличивает, а в дозе 1359 Дж/м - уменьшает количество СБ3-комплексов на поверхности их мембран. Показано, что введение цитокина в концентр ациях 0,01-100 МЕ/мл в суспензию облученных Т-лимфоцитов нивелирует иммунодепрессивное действие максимальной дозы УФ -излучения (1359 Дж/м ), способствуя восстановлению и усилению их антигенраспознающей способности. Полученные данные об антигенраспознающей способности УФ-облученных Т-лимфоцитов крови человека, модифицированных а-интерфероном, позволяют прогнозировать результаты проведения сеансов аутотрансфузии УФ-облученной крови при совместном использовании УФ-облучения крови и цитокинотерапии.
Ключевые слова: УФ-излучение, Т-лимфоциты, а-интерферон, рецептор, антигенраспознающий комплекс.
В последнее время в клинической практике нашло широкое применение оптическое излучение различного спектрального диапазона, которое привело к формированию одного из перспективных разделов эфферентной медицины -фотогемотерапии. Весомый вклад в развитие этого направления внесло внедрение в лечебную пр актику ультрафиолетового облучения кр ови. При использовании этого метода были обнаружены такие лечебные эффекты, как бактер и-цидный, противовоспалительный, иммунокор-ригирующий, комплексный иммуностимулирующий (увеличение количества и активности иммунокомпетентных клеток в циркулирующей крови, стимуляция выработки иммуноглобулинов, компонентов комплемента) и др. [1,2]. Установлено, что облучение УФ-светом с длинами волн 254 нм или 280 - 400 нм в терапевтических дозах индуцирует структурные изменения поверхности клеток крови, шеддинг надмембран-ных компонентов, изменение мембранозависи-мых свойств и функций клеток [3-7].
Известно, что УФ -излучение оказывает влияние на процессы модуляции уровня цито-кинов, в частности интерферонов [8], которые в свою очередь играют важную роль в функ-
ционировании иммунной системы. В норме в плазме кр ови интерфероны содержатся в очень малых количествах (не более 4 МЕ/мл) и в основном представлены 14 типами а-интерфе-рона [9], но при различных патологических процессах их уровень может как снижаться, так и значительно повышаться [10].
В современной медицине получили широкое распространение естественные и полученные методом генной инженерии препараты интер-феронов не только для лечения и профилактики вирусных заболеваний (грипп, вирусный гепатит, герпес), бактериальных и протозойных инфекций, аллергозов, аутоиммунных заболеваний (ревматоидный артрит, гломерулонефрит и др.) и онкологических патологий, но и как иммуномодулятор ы широкого спектра действия [9,11,12].
На основании вышеизложенного определенный интерес представляет вопр ос о том, какое влияние оказывает введение в ор ганизм человеческого лейкоцитарного а-интерферона в различных концентрациях на функциональную активность нативных и фотомодифицированных Т-лимфоцитов. Одной из основных функций
Т-клеток является распознавание чужер одного антигена. В связи с тем, что при связывании антигена с Т-клеточным рецептор ом сигнал передается через ассоциированный с ним комплекс трансмембранных пептидов СБ3 внутрь клетки, нами была проведена серия модельных экспериментов, посвященных изучению влияния а-интерферона в диапазоне концентр аций 0,01 -100 МЕ/мл на уровень экспрессии СБ3-ком-плексов на поверхности Т-клеток, облученных УФ в дозах 151-1359 Дж/м2.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Исследования были проведены на клетках крови 15 доноров. Лимфоциты выделяли из гепаринизированной крови методом седиментации на градиенте плотности фиколла-уро-граффина (1,077 г/см3). Разделение клеток на Т- и В-субпопуляции осуществляли по методу
[13].
Суспензии Т-клеток (2-105 клеток в 1 мл) облучали светом ртутно-кварцевой лампы ДРТ-400 в термостатируемой кювете (37°С) через светофильтр УФС-1 с полосой пропускания 240-390 нм в дозах 151, 453, 906, 1359 Дж/м2. Нативные и фотомодифицир ованные Т-лимфо-циты инкубировали с препаратом а-интерфе-рона (Микроген, Москва) в концентрациях 0,01; 0,1; 1; 10 и 100 МЕ/мл в среде ИРМ1 1640 в течение 24 ч при 37°С. Уровнень экспрессии СБ3 антигенов опр еделяли методом непрямого твердофазного иммуноферментного анализа с использованием моноклональных антител мыши серии ЬТ3 (Сорбент, Москва) к компонентам СБ3-комплексов Т-лимфоцитов человека и конъюгата бараньих антител против мыши с пероксидазой хрена (Сорбент, Москва). В качестве субстрата для пероксидазы использовали раствор 3,3',5,5'-тетраметилбензидина в 0,15 моль/л цитратно-ацетатном буфере (рН 5,0). Результаты экспериментов регистрировали на вертикальном фотометр е «Униплан» (Пикон, Москва) при длине волны, равной 450 нм, и выражали в единицах оптической плотности (отн. ед).
Статистическую обр аботку результатов проводили с использованием пакета статистических прогр амм «8ТЛТ18Т1СЛ 6.0».
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Ур овень экспрессии СБ3-комплексов на поверхности мембран нативных Т-лимфоцитов колебался от 0,197 ± 0,008 до 0,210 ± 0,014 отн. ед. и в среднем составил 0,203 ± 0,003 отн. ед.
Инкубация нативных Т-клеток с препаратом человеческого лейкоцитарного а-интерферона во всем используемом диапазоне концентраций (0,01-100 МЕ/мл) приводила к увеличению ур овня экспр ессии СБ3-комплексов на поверхности их мембран от 0,236 ± 0,002 до 0,358 ± 0,009 отн. ед. (на 16-34%) по сравнению с контр олем. Наибольшее количество СБ3 молекул (0,358 ± 0,009 отн. ед.) отмечалось на поверхности нативных Т-лимфоцитов после модификации а-интерфероном в дозе 10 МЕ/мл (таблица).
После облучения Т-клеток малой дозой УФ-света (151 Дж/м2) количество антигенов на их поверхности увеличивалось на 16% по сравнению с нативными лимфоцитами (0,235 ± 0,005 отн. ед.). Модификация малыми концентрациями цитокина (0,01 и 0,1 МЕ/мл) УФ -облученных клеток не приводила к статистически достоверным изменениям количества СБ3 молекул на их мембранах. Инкубация фотомодифициро-ванных Т-лимфоцитов с а-интер фероном в концентрациях 1 и 10 МЕ/мл способствовала снижению ур овня экспрессии СБ3-комплексов на 15 и 20% до 0,199 ± 0,024 отн. ед. и 0,189 ± 0,018 отн. ед. соответственно, а в концентр ации 100 МЕ/мл - увеличению количества данного антигена на 26% (0,297 ± 0,013 отн. ед.) по сравнению с облученными Т-лимфоцитами.
После воздействия на Т-клетки УФ -излучения в дозе 453 Дж/м2 наблюдалось увеличение регистрируемого показателя на 14%, уровень экспрессии СБ3-комплексов со ставил 0,232 ± 0,008 отн. ед. Последующее добавление интерферона к фотомодифицированным Т-клеткам в концентрациях 0,01-10 МЕ/мл вызывало уменьшение уровня СБ3-комплексов на 9-20% по сравнению с облученными Т-лимфоцитами, а в концентрации 100 МЕ/мл не оказывало статистически достоверного влияния на исследуемый показатель.
Облучение Т-клеток УФ -светом в дозе 906 Дж/м2 увеличивало ур овень ИФА-сигнала исследуемых образцов до 0,240 ± 0,009 отн. ед. (на 18%). Инкубация фотомодифицированных лимфоцитов с человеческим лейкоцитарным интер фероном (0,01-100 МЕ/мл) приводила к дальнейшему возрастанию уровня экспрессии СБ3-комплексов на 15-56%. При воздействии максимальной дозой облучения (1359 Дж/м2) на Т-клетки количество антигенов на их мембране резко снижалось до величины 0,175 ± 0,006 отн. ед. (на 14% относительно контроля). Инкубация этих образцов с цитокином при всех концентрациях способствовала значительному росту уровня ИФА-сигнала до 0,290 ±
254
АРТЮХОВ и др.
Изменение уровня экспр ессии СБ 3-комплексов на поверхности Т-лимфоцитов, модифицированных УФ -светом и а-интер фер оном
УФ-облу- Концентрация а-интер фер она, МЕ/мл
чение, доза, Дж/м2 0,00 0,01 0,10 1,00 10 100
0 0,203 ± 0,003 0,236 ± 0,002* 0,244 ± 0,010* 0,277 ± 0,009* 0,358 ± 0,009* 0,272 ± 0,009*
151 0,235 ± 0,005* 0,224 ± 0,009* 0,234 ± 0,014* 0,199 ± 0,024** 0,189 ± 0,018** 0,297 ± 0,013* **
453 0,232 ± 0,008* 0,190 ± 0,019** 0,186 ± 0,005* ** 0,189 ± 0,022** 0,212 ± 0,008** 0,244 ± 0,017*
906 0,240 ± 0,009* 0,276 ± 0,006* ** 0,293 ± 0,008* ** 0,275 ± 0,009* ** 0,285 ± 0,009* ** 0,374 ± 0,001* **
1359 0,175 ± 0,006* 0,340 ± 0,005* ** 0,386 ± 0,033* ** 0,290 ± 0,008* ** 0,348 ± 0,006* ** 0,380 ± 0,009* **
Примечания. * - Отличия статистически достоверны по сравнению с нативным образцом, а = 0,05; ** - отличия статистически достоверны по сравнению с фотомодифицированными лимфоцитами, а = 0,05.
0,008 - 0,386 ± 0,033 отн. ед. (на 66-120%), что свидетельствует о стимулирующем влиянии а-интерферона на экспрессию СБ3 молекул фотомодифицированными лимфоцитами.
Таким образом, облучение Т-лимфоцитов УФ -светом в дозах 151-906 Дж/м2 индуцирует увеличение экспрессии СБ3-комплексов на поверхности мембр ан Т-лимфоцитов крови человека от 14 до 18%, а в дозе 1359 Дж/м2 -снижение исследуемого параметр а на 14%.
Добавление а-интерферона в концентрациях 1 и 10 МЕ/мл к суспензии лимфоцитов, модифицированных малыми дозами УФ-света (151 и 453 Дж/м2 ), угнетало экспрессию СБ3-ком-плекса. Воздействие а-интер ферона в диапазоне концентраций 0,01-100 МЕ/мл на лимфоциты, облученные большими дозами УФ -света (906 и 1359 Дж/м2), активировало экспрессию СБ3-комплексов на поверхности их мембран.
Нами было установлено, что цитокин может нейтрализовать иммунодепрессивное действие максимальной дозы УФ-излучения (1359 Дж/м2), способствуя восстановлению и двукратному усилению функциональной активности Т-лим-фоцитов, что указывает на зав
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.