ИЗВЕСТИЯ РАН. СЕРИЯ БИОЛОГИЧЕСКАЯ, 2014, № 3, с. 246-253
МИКРОБИОЛОГИЯ
УДК 631.41
ЭКОФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ АКТИНОМИЦЕТОВ ПУСТЫННЫХ ПОЧВ МОНГОЛИИ
© 2014 г. Г. М. Зенова, П. А. Кожевин, Н. А. Манучарова, Д. А. Лубсанова, М. С. Дуброва
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, ф-т почвоведения,
119991 Москва, Ленинские горы, 1
E-mail: zenova38@mail.ru Поступила в редакцию 26.10.2012 г.
Показано, что актиномицетный комплекс в остепненно-пустынной светло-бурой засоленной почве пустынных степей Монголии представлен родами Streptomyces и Micromonospora. Видовое разнообразие доминирующего в комплексе рода Streptomyces уменьшается с возрастанием осмолярности среды. Установлено влияние экологических факторов — температуры и осмолярности среды — на развитие метаболически активных представителей филума Actinobacteria в домене Bacteria прока-риотного микробного сообщества почвы. Доля метаболически активных бактерий, относящихся к представителям актинобактерий, увеличивается с возрастанием осмолярности и температуры инкубирования почвы. Обнаружено доминирование в филуме Actinobacteria мицелиальных метаболически активных представителей над одноклеточными. Галотолерантные актиномицеты, выделенные из остепненно-пустынной почвы, оказались алкалотолерантными, ксерофильными и термотолерантными, обладающими антимикробными свойствами против грамположительных бактерий и актиномицетов.
DOI: 10.7868/S0002332914030163
Пустыни — уникальные экосистемы, в которых организмы способны существовать при экстремальных значениях температуры и влажности, часто при повышенном содержания солей (Chanal etal., 2006; Common etal., 2007; Okoro etal., 2009). Почвенный покров зоны пустынных степей Монголии представлен сложными комплексами очень разной степени солонцеватости и засоления. Летом поверхность почвы днем нагревается до 70°С. Именно в таких местообитаниях развиваются гало-, алкало-, ксеро- и термотолерантные микроорганизмы. Среди сведений о мицели-альных бактериях, населяющих пустынные местообитания, находим лишь разрозненные данные о функциональной активности актино-мицетов с различной адаптацией к солености, температуре и кислотности среды. С практической точки зрения важно знать, как адаптации к экстремальным факторам влияют на интенсивность дыхания микроорганизмов, а следовательно, на эмиссию СО2 — одного из "парниковых газов", значимых для потепления климата на Земле.
Микроорганизмы таких мест обитания, как пустыни, нередко являются продуцентами биологически активных веществ (Al-Tai, Ruan, 1994; Kurzbaum et al., 2010). Поэтому актуально изучение микробного населения пустынных почв, важную роль в котором играют мицелиальные акти-нобактерии — актиномицеты. Эти гидролитиче-
ские микроорганизмы — продуценты многих антибиотиков, витаминов, ферментов.
Цель работы — оценка численности, таксономической структуры, метаболической и функциональной активности гало-, термо- и ксеротолерантных актиномицетов пустынных почв Монголии.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объектами исследования служили образцы остепненно-пустынной светло-бурой засоленной почвы (К-Е-Б1-Бса-БС8а), отобранные в зоне пустынных степей Монголии. Пустынные степи Монголии находятся в пределах внутреннего Центрально-Азиатского бассейна, относятся к ландшафтам Центральной Азии и занимают огромное пространство к югу от зоны сухих степей. На севере они ограничены отрогами Хангая, а на юго-западе — хребтами Монгольского и Го-бийского Алтая. Эта зона характеризуется присущими только ей чертами, значительно отличается от полупустынь Казахстана и Средней Азии. В отдельные годы с малым количеством осадков пустынные степи выглядят пустыней, а во влажные годы их облик резко меняется, они напоминают степь.
Для почв Гобийской области характерны: развитие процессов аридного почвообразования без современного соленакопления; образование щеб-
нистого и щебнисто-древянистого панциря на поверхности почв; низкое содержание гумуса; отсутствие в профиле легкорастворимых солей и гипса; остаточные засоленность, карбонатность, солон-цеватость (проявляются при формировании почв на древних мел-палеогеновых глинистых отложениях дельтово-лагунного типа); заторможенность биологической активности почв из-за острого дефицита влаги; сильное развитие процессов дефляции и сайровой эрозии (сайры — временные русла); укороченность профиля (Доржготов, 1992). Почвенному покрову пустынных степей Монголии в отличие от полупустынных почв Казахстана и Средней Азии свойственны малое развитие микрокомплексности, слабая гипсоносность и отсутствие в почве фитогенного накопления солей (Почвенный покров..., 1978).
Для выделения и дифференцированного учета актиномицетов использовали метод посева из разведений почвенных суспензий на плотные питательные среды: Гаузе 1 (Гаузе и др., 1983), модифицированные среды Гаузе 1 (содержание в среде NaCl 2 или 5%; содержание солей MgCl2 и Na2SO4 0.05, 3 или 5%). Использование Na2SO4 и MgCl2 в питательной среде имитировало природный характер засоления (хлоридно-сульфатный) в исследуемом почвенном образце остепненно-пу-стынной светло-бурой почвы (Звягинцев, Зенова, 2007).
В питательные среды добавляли нистатин (50 мкг/мл) для ограничения роста грибов и на-лидиксовую кислоту (5 мкг/мл) для ограничения роста немицелиальных бактерий. Инкубировали посевы при 28, 37 или 45°C.
Проводили дифференцированный количественный учет актиномицетов, выросших на ага-ризованной питательной среде. Предварительно актиномицеты идентифицировали при первичном микроскопировании колоний на чашках с питательной средой, затем выделяли в чистую культуру на овсяном агаре (Гаузе и др., 1983) представителей определенных доминирующих мор-фотипов. Для предварительной идентификации использовали следующие фенотипические признаки: морфологические (наличие фрагментации мицелия, образование спор на субстратном и/или воздушном мицелии, число спор в цепочках, наличие одиночных спор, спорангиев) и хемотаксо-номические (присутствие L- или мезоизомера ди-аминопимелиновой кислоты (ДАПк) и дифференцирующих сахаров в гидролизатах целых клеток). Использовали определители бактерий (Bergey's..., 1989; Определитель бактерий Берджи, 1997), отдельные публикации (Агре, 1986; Stackebrandt et al, 1997; Kim et al, 1999; Goodfellow, Quintana, 2006; Kroppenstedt, Goodfellow, 2006).
Оптимальные и ограничительные для роста культур стрептомицетов температуры определяли
по значениям радиальной скорости роста колоний на плотной питательной среде Гаузе 1 при различных температурах (5, 8, 10, 15, 20, 28, 37, 45, 50 и 550C) или при различных концентрациях NaCl (0.05, 2 и 5%) в среде. Расчет радиальной скорости роста колоний проводили согласно методике Кураповой и др. (2012).
Молекулярный метод гибридизации in situ (fluorescent in situ hybridization (FISH)) использовали для оценки биомассы метаболически активных клеток бактерий (Amann, Ludwig, 2000; Мануча-рова, 2008). Применяли спектр зондов, специфичных для представителей домена Bacteria и для отдельного филума Actinobacteria (Roller et al., 1994). Использовали рРНК-специфичные флуоресцентно-меченные олигонуклеотидные зонды с последовательностью нуклеотидов для группы Bacteria: 5'-GCT GCC TCC CGT AGG AGT-3' и Actinobacteria: 5'-TAT AGT TAC CAC CGC CGT-3' в сочетании с немеченым олигонуклеотидом 5'-TAT AGT TAC GGC CGC CCGT-3'.
Препараты анализировали с применением люминесцентного микроскопа Zeizz Axioskop 2 plus (Германия) со светофильтрами Filter set 15 для зондов и Filter set 09 для окраски акридиновым оранжевым. Численность целевых групп микроорганизмов в образцах определяли путем учета числа гибридизированных с зондами клеток в 150 полях зрения микроскопа, после чего рассчитывали численность соответствующих популяций на 1 г почвы (Манучарова, 2008).
Опыты проводили в микрокосмах с остепнен-но-пустынной светло-бурой засоленной почвой, микробную сукцессию инициировали увлажнением почвы (60% полной влагоемкости), внесением NaCl (в концентрации 2 или 5% массы почвы) и инкубированием при разных температурах (28 или 45 °C).
Для анализа характера потребления субстратов (функциональной активности) и интенсивности выделения CO2 (как одного из "парниковых газов") актиномицетами, различающимися температурной и осмотической адаптациями, использовали метод мультиреспирометрического тестирования (МРТ). Метод МРТ основан на анализе показателей дыхания сообщества или популяций при использовании разных ресурсов (Campbell et al., 2003). В нашем случае использовался модифицированный метод МРТ (Марченко и др., 2005).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Численность актиномицетов, выделенных из гумусового горизонта засоленной остепненно-пустынной светло-бурой почвы Монголии, составила десятки и сотни тысяч колониеобразую-щих единиц в 1 г почвы (КОЕ/г почвы) и колеба-
лась незначительно (недостоверно) по мере увеличения концентрации солей Na2SO4 и MgCl2 в среде выделения от 0.05 до 3% и далее до 5%. На среде с NaCl отмечено значительное уменьшение численности с увеличением осмолярности. При 5%-ной концентрации соли в среде выделения не удалось обнаружить актиномицетов в почве. Полученные результаты можно объяснить химическими особенностями исследуемой почвы — относительно низкой степенью хлоридно-сульфатного засоления почвы (содержание легкорастворимых солей 3%). Численность актиномицетов в почвах пустынных степей Монголии колеблется от тысяч до миллионов КОЕ/г почвы в зависимости от типа почвы (Курапова и др., 2012).
Традиционно в работах с галофильными акти-номицетами (Звягинцев, Зенова, 2007) предложено использовать коэффициент галофильности (Khal) — соотношение численности актиномицетов, выделенных на среде с 5%-ным содержанием солей Na2SO4 и MgCl2, и численности актиномицетов, выделенных на среде с традиционным содержанием солей в среде (0.05%). Khal отражает тенденцию к увеличению (Khal > 1) или уменьшению (Khal < 1) численности галотолерантных актиномицетов в исследуемой почве. В случае исследуемой остепненно-пустынной светло-бурой засоленной почвы Khal = 0.9, т.е. среднему значению Khal для черно
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.