ИЗВЕСТИЯ РАН. СЕРИЯ БИОЛОГИЧЕСКАЯ, 2015, № 5, с. 477-486
= БОТАНИКА
УДК 575.224;581.52;582.475
ЭКОТОПИЧЕСКАЯ ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ ЖЕЛТОПЫЛЬНИКОВОЙ И КРАСНОПЫЛЬНИКОВОЙ ФОРМ СОСНЫ ОБЫКНОВЕННОЙ ПО КАРИОЛОГИЧЕСКИМ ПРИЗНАКАМ И СОДЕРЖАНИЮ ЯДЕРНОЙ ДНК
© 2015 г. Т. С. Седельникова, А. В. Пименов
Институт леса им. В.Н. Сукачева СО РАН, 660036 Красноярск, Академгородок, 50, стр. 28 E-mail: tss@ksc.krasn.ru Поступила в редакцию 14.10.2013 г.
Проведено сравнительное исследование желтопыльниковой и краснопыльниковой форм сосны обыкновенной, произрастающих в гидротермически контрастных болотных и суходольных экото-пах, по кариологическим признакам и содержанию ядерной ДНК. Выявлены определенные различия между желто- и краснопыльниковыми формами сосны как компонентами внутривидового разнообразия по частоте встречаемости нарушений числа хромосом, размерам хромосом (суммарной длине диплоидного набора, абсолютной и относительной длинам), центромерному индексу, локализации вторичных перетяжек в хромосомах, а также по количеству ДНК.
DOI: 10.7868/S0002332915050124
Сосна обыкновенная Pinus sylvestris L. — один из основных лесообразующих видов Евразии. Разнообразный эколого-географический фон в пределах обширной территории, которую охватывает ареал сосны обыкновенной, обусловливает большое число форм, рас и разновидностей, образовавшихся в процессе эволюции данного вида. У сосны обыкновенной описаны две внутривидовые формы по окраске микростробилов: f. (var.) sulfuranthera Kozubow и f. (var.) erythrantera Sanio — желтопыльниковая и краснопыльниковая соответственно. Однако доли их участия в составе популяций в различных частях видового ареала неодинаковые (Правдин, 1964). Установлено, что в микростробилах краснопыльниковой формы содержится значительное количество растительного гликозида антоциана (Козубов, 1962). Присутствие антоциана у растений имеет адаптивное значение в условиях низких температур (Фадеева и др., 1980). Действительно, доля краснопыльни-ковой формы в сосновых древостоях повышается с нарастанием континентальности климата, а также в экстремальных условиях, связанных с ухудшением температурного режима местообитаний (в северных, горных и болотных экотопах) (Черепнин, 1980; Седельникова и др., 2004; Новикова, 2012).
Показано, что селективное преимущество желто- и краснопыльниковых форм сосны в тех или иных условиях произрастания обусловлено их различиями по эмбриологическим, морфологическим и лесоводственным признакам, а также
по устойчивости к неблагоприятным факторам среды (Божок, 1979; Бабушкина и др., 1997; Пименов и др., 2011). Однако хромосомный полиморфизм и изменчивость количества ядерной ДНК (яДНК), которые также могут отражать особенности адаптации этих форм сосны в экстремальных экотопах, не изучались.
Цель работы — сравнительное исследование желто- и краснопыльниковых форм сосны обыкновенной, произрастающих в экстремальных (болотных) и оптимальных (суходольных) экотопах, по числу хромосом, их размерам и морфологии, а также по содержанию яДНК.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Исследования проводились в южно-таежной подзоне Западной Сибири на территории Томской обл. Объектами исследования послужили экологически контрастные в соответствии с температурными и почвенно-гидрологическими условиями среды типы сосновых лесов (популяции): сосняки кустарничково-сфагновые класса Уа бонитета (низкие рямы) на глубокозалежных олиготрофных болотах (Киргизное — 56°21' с.ш., 84°34' в .д.; Цыганово - 56°22' с.ш., 84°26' в.д.; Бакчарское — 56° 52' с.ш., 82°40' в.д.; Инкинский рям — 58°26' с.ш., 82°05' в.д.); сосняки лишайни-ково-зеленомошные и зеленомошно-бруснич-ные классов 1—11 бонитета на прилегающих к болотам минеральных суходолах. В сосняках, произрастающих на олиготрофных болотах,
Рис. 1. Метафазная пластинка желтопыльниковой формы сосны обыкновенной с болота с указанием измеряемых морфометрических параметров хромосом. 1—24 — номера хромосом. На примере хромосомы 1 показана схема измерения абсолютной длины хромосомы с учетом локализации вторичных перетяжек на плечах хромосомы: Х1 — абсолютная длина хромосомы (1?, мкм), как сумма длин ее плеч; Х2 — длина короткого плеча хромосомы; Х3 — длина длинного плеча хромосомы от центромеры до вторичной перетяжки; Х4 — длина длинного плеча хромосомы от вторичной перетяжки до теломеры. Масштаб: 10 мкм.
соотношение деревьев красно- и желтопыльни-ковых форм, %, составляет в среднем 29 : 71, в суходольных сосняках — 7 : 93 соответственно.
Было сформировано четыре выборки семян сосны обыкновенной, каждая из которых собиралась с 30 деревьев: 1 и 2 — желто- и краснопыль-никовые формы соответственно с олиготрофных болот Киргизное, Цыганово, 3 и 4 — желто- и краснопыльниковые формы соответственно с суходола.
Для кариологического анализа использовали меристематические ткани кончиков корней. Проростки подвергали предфиксационной обработке 1%-ным раствором колхицина в течение 4— 6 ч, промывали в дистиллированной воде, фиксировали спиртово-уксусной смесью (3 : 1). Затем проростки окрашивали 1%-ным раствором аце-тогематоксилина после их предобработки 4%-ным раствором железоаммонийных квасцов в течение 10—15 мин. Для просмотра использовали "давленые" препараты, приготовленные стандартным способом. Препараты просматривали в проходящем свете под микроскопом Axiostar plus (Carl Zeiss, Германия) с использованием системы фор-
мирования изображений AxioVision (Германия). Подсчет числа хромосом проводился в метафаз-ных клетках. Метафазные пластинки с полным набором хромосом, их хорошим разбросом и сходными степенями спирализации фотографировали в иммерсионной системе (объектив х90). Для каждой хромосомы измеряли абсолютную длину (La, мкм) как сумму длин обоих плеч хромосомы (рис. 1). Суммарную длину диплоидного набора хромосом (ZLa, мкм) вычисляли как сумму абсолютных длин всех хромосом, относительную длину (Lr, %) — как отношение длины хромосомы к суммарной длине диплоидного набора хромосом, центромерный индекс (Iе, %) — как отношение длины короткого плеча к длине хромосомы. У хромосом, имеющих вторичные перетяжки (sc), определяли их локализацию на плечах хромосомы как отношение расстояния от перетяжки до центромеры к длине плеча хромосомы. Классификацию хромосом проводили в соответствии с методикой Грифа, Агаповой (1986).
Количественное определение ДНК проводили совместно с НП "Сибирский центр лесной сертификации" (Красноярск). Использовали четыре
Рис. 2. Метафазные пластинки с диплоидным и тетраплоидным наборами хромосом у сосны обыкновенной. а — 2п -= 24 — желтопыльниковая форма с суходола; б — 2п = 48 — желтопыльниковая форма с болота. Масштаб: 10 мкм.
выборки, состоявшие из образцов хвои сосны обыкновенной, каждая из которых собиралась с 8 деревьев: 1 и 2 — желто- и краснопыльниковые формы соответственно с олиготрофного болота Инкинский рям, 3 и 4 — желто- и краснопыльни-ковые формы соответственно с олиготрофного болота Бакчарское. Образцы хвои помещались в бумажные пакеты, сушились в течение 40 ч при 40°С в сухожаровом шкафу (Binder, Германия).
Для количественного определения содержания ДНК брали 150 мг (0.15 г) измельченной хвои и помещали в ступки. Гомогенизацию материала проводили жидким азотом, количественно переносили 1.5 мл буфера СТАВ в пробирки (Eppendorf, Германия) и смешивали на встряхивателе Vortex (Латвия). Выделение ДНК проводили по методике Падутова с соавт. (2007).
Пробирки прогревали в течение 60 мин в твердотельном термостате при 60°С. Затем встряхивали на Vortex, центрифугировали при 15000 об./мин в течение 20 мин при 15°С, 600— 700 мкл супернатанта отбирали в чистую пробирку, добавляли равное количество хлороформа (для осаждения белков), перемешивали на Vortex 30 с, центрифугировали при 15000 об./мин в течение 20 мин при 4°С. После этого 500 мкл суперна-танта отбирали в чистую пробирку, добавляли 700 мкл изопропанола, встряхивали на Vortex. Затем инкубировали при комнатной температуре 10 мин, центрифугировали при 15000 об./мин в течение 20 мин при 4°С, удаляли надосадочную жидкость с помощью насоса и колбы-ловушки до сухого остатка. В осадке содержались ДНК и полисахариды. Осадок отмывали от остатков буфера, изопропанола и хлороформа 3 раза 70%-ным этанолом (по 1000 мкл 1 раз и по 500 мкл 2 раза с встряхиванием каждый раз на Vortex), центрифугировали при 4°С по 10 мин и высушивали в ла-
минарном боксе. В дальнейшем осадок растворяли в 100 мкл деионизированной воды. Пробирки встряхивали на Vortex и помещали в термошейкер на 40 мин при 1000 об./мин и 40°С при периодическом встряхивании на Vortex (2—3 раза). Концентрацию ДНК определяли на спектрофотометре (BioRad Smartspec Plus, США). 100 мкл исследуемого раствора с растворенной ДНК помещали в стерильные одноразовые пластиковые кюветы BioRad (пропускная способность 220—1100 нм), контролем служила деионизированная вода. Расчет концентрации ДНК (Сх) проводился по формуле: Сх = С х 10 / сухой вес навески / 1000, где С — полученное значение концентрации ДНК (ОП260/ОП280), 10 — коэффициент пересчета на 1 мл (брали 100 мкл), 1000 — коэффициент пересчета концентрации ДНК из микрограммов в миллиграммы, ОП260/ОП280 — оптическая плотность образца при длине волны X = 260 и 280 нм.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В диплоидном наборе как желто-, так и краснопыльниковой форм сосны обыкновенной, произрастающих на суходоле и на болоте, имеется 24 хромосомы (2n = 24). В отдельных случаях отмечена миксоплоидия — нарушение числа хромосом, при котором в проростках наряду с диплоидными содержатся полиплоидные клетки (2n = = 36, 2n = 48). Метафазные клетки с диплоидным и тетраплоидным наборами хромосом представлены на рис. 2. На суходоле встречаемость полиплоидных клеток у желтопыльниковой формы сосны составляет 1.5, у краснопыльниковой — 2%. На болоте полиплоидные клетки встречаются у желтопыльниковой формы сосны с частотой 6, у краснопыльниковой — 2.5%. Очевидно, что отклонения числа хромосом от нормального наибо-
6 г
(а)
280
320
360
400
410
480
280
320
360
400
410
480
Рис. 3. Изменчивость суммарной длины хромосомного набора желтопыльнико
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.