РАДИАЦИОННАЯ БИОЛОГИЯ. РАДИОЭКОЛОГИЯ, 2015, том 55, № 2, с. 160-168
МОДИФИКАЦИЯ РАДИАЦИОННЫХ ЭФФЕКТОВ =
УДК [57+61]::539.1.04:615.84:611.018:576.353.4:599.323.4:58.02
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ОЦЕНКА ВЛИЯНИЯ СИНТЕТИЧЕСКОГО ГЕНИСТЕИНА НА ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ И ЦИТОКИНОВЫЙ СТАТУС ОБЛУЧЕННЫХ КРЫС
© 2015 г. А. Н. Гребенюк1, 2, Р. А. Тарумов1*, В. А. Башарин1, В. Л. Пастушенков1, В. Ю. Ковтун3
1Военно-медицинская академия, Санкт-Петербург 2 Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины МЧС России, Санкт-Петербург 3НПЦ "Фармзащита"ФМБА России, Химки
Установлено, что на фоне введения крысам генистеина в дозе 200 мг/кг за 1 ч до облучения уровень содержания в крови нейтрофилов к 1-м сут исследования превышал показатели контроля в 1.32 раза, а к 7-м сут — в 1.53 раза. На 3-и и 7-е сут наблюдения у защищенных генистеином животных регистрировали повышение числа тромбоцитов в 2.25 и 2.33 раза соответственно по сравнению с группой контроля. Содержание интерлейкина-1 (ИЛ-1) у защищенных генистеином животных через 3 ч после радиационного воздействия повышалось в 1.25 раза, а ИЛ-2 — в 1.21 раза. Через 72 ч после облучения у животных на фоне введения им генистеина содержание ИЛ-1 было в 1.35 выше, чем в контроле. Результаты исследования свидетельствуют, что синтетический генистеин обладает гемо-и иммуностимулирующими эффектами, которые лежат в основе радиорезистентности облученного организма.
Облучение, синтетический генистеин, радиозащитная эффективность, периферическая кровь, клетки крови, цитокины.
БОТ: 10.7868/80869803114060058
Использование источников ионизирующих излучений в промышленности, науке и медицине в ряде случаев может привести к сверхнормативному воздействию радиации как на отдельного человека, так и на популяцию в целом [1, 2]. Эти ситуации требуют дальнейшего совершенствования радиационной безопасности, важным элементом которой является профилактика с использованием фармакологических средств. Однако разработанные к настоящему времени радиозащитные препараты далеки от совершенства, вследствие чего создание и испытание новых высокоэффективных медицинских средств противорадиационной защиты является одной из актуальных проблем современной радиобиологии и радиационной фармакологии [3, 4].
В настоящее время работы по поиску, разработке, созданию и экспериментальному изучению безопасности, фармакодинамики и механизмов действия новых противолучевых лекарственных средств активно продолжаются [5—7]. Большое внимание уделяется веществам природного происхождения и их синтетическим аналогам, кото-
*Адресат для корреспонденции: 194044 Санкт-Петербург, ул. Лебедева, 6, ВМА; тел.: (812) 329-71-60; факс: (812) 29234-94; e-mail: tarumov_ra@mail.ru.
рые могут быть высокоэффективны как при профилактическом, так и лечебном их применении [8—10]. Одним из таких средств является природный изофлавоноид сои — генистеин. В нашей стране химическим путем был синтезирован его аналог. В проведенных ранее исследованиях нами было показано, что синтетический генистеин является малотоксичным соединением [11] и проявляет умеренную противолучевую активность, повышая при этом выживаемость облученных животных [12]. Кроме того, профилактическое введение генистеина облученным мышам способствовало сохранению жизнеспособности значительного числа кроветворных клеток-предшественников гемо-поэза, о чем свидетельствуют данные, полученные при исследовании противолучевой эффективности препарата в методиках эндогенного и экзогенного колониеобразования [12]. Однако изучение влияния синтетического генистеина на клеточный состав периферической крови и содержание в сыворотке ци-токинов до настоящего времени не проводилось, что и послужило основанием для выполнения настоящей работы.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА
Экспериментальные исследования выполнены на 86 белых беспородных крысах-самцах, полученных из питомника лабораторных животных "Рапполово" (пос. Рапполово Ленинградской обл.).
Животных содержали в условиях вивария не более чем по 8 крыс в клетке. Доступ животных к стандартному гранулированному корму и воде не ограничивался (режим питания — ad libitum). Перед проведением каждого эксперимента животные находились под наблюдением (в карантине) в течение не менее 14 сут. После окончания карантина крыс распределяли на группы методом рандомизации, больных и ослабленных животных в эксперимент не брали. При проведении исследования выполняли требования нормативно-правовых актов о порядке экспериментальной работы с использованием животных, в том числе по гуманному отношению к ним [13].
В работе использовали генистеин — препарат, синтезированный в Научно-производственном центре "Фармзащита" ФМБА России. В качестве растворителя для генистеина использовали 60%-ный водный раствор диметилсульфоксида (ДМСО). Генистеин крысам опытных групп вводили внутрибрюшинно в дозе 200 мг/кг в объеме 0.1 мл на 100 г массы тела животного. Животным контрольных групп в те же сроки и в том же объеме внутрибрюшинно вводили равный объем 60%-ного ДМСО.
Крыс подвергали общему равномерному рентгеновскому облучению в дозе 6 Гр на установке "РУМ-17" (Россия) при напряжении 180 кВ, силе тока 10 мА, фильтре 0.5 мм Си + 1.0 мм Al, направлении облучения спина — грудь, кожно-фокусном расстоянии 50 см, мощности дозы 0.2 мА/кг (38.4 Р/мин). Дозиметрический контроль проводили с помощью индивидуального дозиметра "ИД-11" (Россия) с последующей оценкой показаний прибора на аппарате "ГО-32" (Россия) .
Эксперименты, направленные на определение гематологических показателей периферической крови у облученных животных, проводили на 32 белых беспородных крысах-самцах, разделенных на четыре группы (3 — опыт, 1 — контроль). Генистеин животным опытных групп вводили за 1 сут, 1 ч до или через 1 ч после радиационного воздействия. Облученные животные контрольной группы в те же сроки получали растворитель. Изучали влияние препарата на пострадиационную динамику общего количества лейкоцитов, эритроцитов и тромбоцитов, содержание абсолютного числа нейтрофилов и лимфоцитов в периферической крови облученных животных кон-
трольных и опытных групп на 1-е, 3-и, 7-, 15-, 21-и 28-е сут после облучения. При этом за 3 сут до проведения исследования у всех животных были определены фоновые значения исследуемых показателей. Кровь у животных забирали в пробирки "Эппендорф" из хвостовой вены путем надреза. В пробирки предварительно вносили по 5 мкл 10%-ного раствора Со-ЭДТА. Определение общего количества лейкоцитов, эритроцитов и тромбоцитов в периферической крови лабораторных животных проводили пробирочным методом [14] с последующим подсчетом числа клеток в камере Горяева с использованием микроскопа "Микмед-6" (Россия).
Для исследования лейкоцитарной формулы применяли способ быстрой окраски мазков крови краской Романовского по Н.Г. Алексееву [15]. Расчет абсолютных значений количества нейтро-филов и лимфоцитов в периферической крови проводили путем умножения процента содержания клеток данной популяции в лейкоцитарной формуле на абсолютное количество лейкоцитов.
Эксперименты по оценке влияния генистеина на цитокиновый статус животных были выполнены на 54 крысах-самцах, разделенных на три группы. Опытной группе животных вводили генистеин за 1 ч до радиационного воздействия. Группа контроля состояла из облученных крыс, которые в тот же срок получали только растворитель. В исследование были также включены ин-тактные животные, составляющие группу биологического контроля. Сразу после облучения, а также через 3, 24 и 72 ч после воздействия радиации определяли содержание в сыворотке крови животных провоспалительных цитокинов — интерлей-кина-1 (ИЛ-1), -2 (ИЛ-2) и -6 (ИЛ-6). Забор материала после декапитации животных производили в пластиковые пробирки "Vacuette" (Австрия), содержащие активатор свертывания. Кровь отстаивали в течение 30 мин при температуре +4°C, а затем центрифугировали при 3000 об./мин в течение 10 мин. После центрифугирования сыворотку отбирали пипеткой в пробирки типа "Эппендорф", после чего на анализаторе "Multiskan Spectrum" (Финляндия) с использованием реактивов "Век-тор-Бест" (Россия) проводили определение концентрации цитокинов в биоматериале.
Статистическую обработку полученных результатов проводили на персональном компьютере с помощью пакета прикладных программ STATISTICA 5.5. В каждой группе рассчитывали средние значения показателя и ошибку среднего. Достоверность различий с значениями в соответствующей контрольной группе оценивали по t-критерию Стьюдента.
Таблица 1. Влияние генистеина на абсолютное количество лейкоцитов в периферической крови белых беспородных крыс-самцов, подвергнутых острому рентгеновскому облучению в дозе 6 Гр, х 109/л (Х ± тх, п = 8)
Сроки исследования после облучения, сут Группы
облучение (контроль) генистеин (за 24 ч) + облучение генистеин (за 1 ч) + облучение облучение + генистеин (через 1 ч)
До облучения 12.5 ± 3.2 13.1 ± 1.9 12.9 ± 2.8 10.9 ± 1.4
1 4.7 ± 0.3 3.6 ± 0.7 6.3 ± 0.6* 4.2 ± 0.4
3 1.5 ± 0.2 1.1 ± 0.1 1.7 ± 0.2 0.7 ± 0.1*
7 3.0 ± 0.6 0.9 ± 0.2* 4.3 ± 0.7* 0.9 ± 0.1*
15 3.1 ± 0.5 3.5 ± 1.3 3.3 ± 1.3 1.9 ± 0.2*
21 11.8 ± 1.2 13.2 ± 6.8 11.2 ± 6.8 10.5 ± 0.7
28 11.3 ± 1.4 13.2 ± 1.4 10.8 ± 1.2 8.9 ± 0.5
* Отличие (по ¿-критерию Стьюдента) от группы "облучение" достоверно,р < 0.05.
РЕЗУЛЬТАТЫ
На первом этапе исследования была проведена оценка влияния синтетического генистеина на клеточный состав периферической крови облученных животных.
Как видно из данных, представленных в табл. 1, острое рентгеновское облучение в дозе 6Гр приводило к резкому снижению общего числа лейкоцитов в периферической крови крыс в ранние сроки после радиационного воздействия. Так, на 1-е сут наблюдения общее количество лейкоцитов снизилось до 38% от фонового (до облучения) значения, а на 3-и сут величина этого показателя составила уже 12%. Начиная с 7-х сут, отмечалось постепенное восстановление числа лейкоцитов в периферической крови облученных крыс.
Введение генистеина животным профилактически за 24 ч до облучения или в схеме ранней терапии через 1 ч после облучения не пр
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.