ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2014, том 50, № 2, с. 156-162
УДК 582.282.23.04:577.152.34
ЭКСПОРТ ИНВЕРТАЗЫ КЛЕТКАМИ ДРОЖЖЕЙ Candida utilis
© 2014 г. О. В. Алексеева, Т. А. Сабирзянова, И. О. Селях, Т. С. Калебина, И. С. Кулаев
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, биологический факультет, Москва, 119991 e-mail:info@mail.bio.msu.ru Поступила в редакцию 10.07.2013 г.
Исследован экспорт и накопление различных форм инвертазы (КФ 3.2.1.26) в клеточной стенке и культуральной среде дрожжей Candida utilis. Обнаружено, что в клеточной стенке присутствует не экспортируемая в культуральную среду высокомолекулярная CW-форма инвертазы, на треть более гликозилированная, чем описанная ранее экспортируемая S-форма данного фермента. Показано, что одна из двух экспортируемых в культуральную среду форм инвертазы, гликозилированная S-форма, задерживается в клеточной стенке, в то время, как другая, негликозилированная F-форма, в клеточной стенке не обнаруживается. На основании этих результатов, а также данных о динамике распределения фермента в культуральной жидкости и клеточной стенке на разных стадиях роста культуры дрожжей, высказано предположение, что негликозилированная форма экспортируется в культуральную жидкость через зоны аномальной проницаемости клеточной стенки, а гликозилированные формы этого фермента (как экспортируемая, так и неэкспортируемая) данный путь не используют, при этом степень N-гликозилирования является важным фактором, определяющим место конечной локализации фермента.
DOI: 10.7868/S0555109914020032
Инвертаза (КФ 3.2.1.26) катализирует расщепление сахарозы с образованием глюкозы и фруктозы в эквимолярном соотношении. Фермент широко используется в промышленном производстве жидких сахаров, искусственного меда, некристаллизующихся кремов, а также варений [1]. Одним из основных промышленных продуцентов инвертазы являются дрожжи, у которых обнаружено несколько форм этого фермента. Выход инвертазы в среду культивирования ограничен и существенная часть инвертазы задерживается внутриклеточно. До настоящего момента исследователи полагали, что основная часть инвертазы в клетках дрожжей накапливается в цитоплазме и/или периплазматическом пространстве [2, 3].
В последнее время наибольший коммерческий интерес в качестве продуцента инвертазы привлекли дрожжи Candida utilis, поскольку они характеризуются высоким уровнем секреции белков, а также способны быстро накапливать биомассу, используя при этом дешевые источники углерода, включая моно- и дисахариды, такие, как сахароза, ксилоза и мальтоза [4, 5]. В настоящее время описаны гликозилированная высокомолекулярная инвераза дрожжей C. utilis, так называемая S-форма (102 кДа), у которой гликозид-ная часть составляет около 40% молекулярной массы и в основном представляет собой N-свя-
занные гликозиды высокоманнозного типа и негликозилированная низкомолекулярная инвертаза — Б-форма (62 кДа). Обе формы способны экспортироваться в культуральную среду, но при этом обе частично накапливаются внутриклеточно [6]. Низкая эффективность выхода фермента в среду культивирования усложняет и делает более дорогостоящим процесс его очистки [5, 7]. Оптимизация процесса промышленного получения инвертазы из дрожжей может быть осуществлена, в частности, за счет увеличения выхода инвертазы из дрожжевой клетки в среду культивирования. Первым шагом на этом пути является выявление причин задержки инвертазы внутри клетки. Данный вопрос мало изучен и есть лишь единичные примеры попыток увеличить выход инвертазы, например случайным мутагенезом [5].
Следует отметить, что у дрожжей выход белков во внешнюю среду осложнен необходимостью их проникновения не только через плазматическую мембрану, но и через дополнительный барьер -клеточную стенку (КС), которая полностью покрывает дрожжевую клетку. Данная стадия секреции у дрожжей носит название экспорта и, в целом, является наименее исследованным звеном в цепи событий, приводящих к выходу белков из клетки в среду. Клеточная стенка дрожжей в основном состоит из глюкана (более 50%) и белков разной степени гликозилирования (около 40%).
Менее 5% КС составляет хитин. Некоторые из белков в процессе экспорта не задерживаясь проходят через клеточную стенку. Некоторые — задерживаются и часть из них прочно закрепляются в КС, образуя или не образуя ковалентную связь с белками и полисахаридами, формирующими структурный каркас КС. Известно, что связь, с помощью которой белки закрепляются на полисахаридах, зависит от типа гликозилирования белковых молекул [8—11]. В то же время вопрос о значении гликозилирования для задержки экспортируемых белков в КС без образования ими ковалентной связи с молекулами полисахаридов — исследован мало. В случае инвертазы неизвестно, задерживается ли данный фермент в клеточной стенке, а если задерживается, то какова роль гликозилирования ее молекулы в этом процессе. При этом, возможно, именно задержка в КС является причиной, по которой не вся инвертаза экспортируется в среду культивирования и накапливается в периплазма-тическом пространстве и цитоплазме.
Цель работы — изучение процесса экспорта инвертазы через клеточную стенку дрожжей C. utilis и получение ответа на вопрос задерживается или нет инвертаза в КС. В случае, если фермент задерживается, ставилась задача — выявить, существует ли зависимость между степенью задержки инвертазы в КС и гликозилированием ее молекулы.
МЕТОДИКА
Штаммы микроорганизмов и условия культивирования. Объектом исследования служили дрожжи Candida utilis ВКМ-У-74 (Всероссийская коллекция микроорганизмов ИБФМ РАН, г. Пущи-но). Дрожжи культивировали при 29°С на среде YEPD (%): дрожжевой экстракт — 1, глюкоза — 0.8, бактопептон — 2, в условиях интенсивной аэрации. Твердая среда для культивирования содержала 2% агара [12].
Получение клеточных стенок дрожжей C. utilis и обработка их трипсином. КС получали путем механического разрушения дрожжевых клеток с последующей отмывкой 1%-ной сахарозой, 1.0 М NaCl и бутанолом в соответствии с методикой [13] с незначительными модификациями. Обработку клеточных стенок трипсином ("Sigma", США) проводили из расчета 0.5—1.0 мг фермента на 1 оптическую единицу (о.е.) КС (D540) в 0.05 М трис-HCl буфере, pH 7.8. Полученную суспензию инкубировали при 37°С в течение 2 ч. Для дальнейшего анализа КС, гидролизованные трипсином, отмывали 1%-ной сахарозой и 4 раза 1%-ным раствором NaCl и 5 раз водой.
Выделение из КС белков, не связанных кова-лентно с полисахаридами [14]. Нековалентно связанные с КС белки выделяли из изолированных КС (~10 о.е. при D540) нагреванием при 95°С в те-
чение 5 мин в 100 мкл модифицированного буфера для образцов [15]. (Далее SEP-белки, сокращение от SDS extractable proteins.)
Электрофорез и блоттинг. Белки разделяли электрофоретически в 10%-ном ПААГ в денатурирующих условиях [15]. Для визуализации белков с антителами к инвертазе проводили перенос белков на 0.45 цм нитроцеллюлозную мембрану ("Schleicher & Schuell", Германия) в буфере, содержащем 100 мМ трис-HCl, pH 8.0, 192 мМ глицин с добавлением 20%-ного метанола, в течение 1 ч при силе тока 5 мА/ см2 [16]. Затем мембрану инкубировали при помешивании 1 ч в TBST-бу-фере (50 мМ трис-HCl, pH 7.5, 0.15 M NaCl, 0.05% твин-80), содержащем 0.4% казеина, затем 1 ч в TBST-буфере, содержащем 0.4% казеина и мышиные антитела к инвертазе, полученные в Институте биофизики клетки РАН (Пущино, Россия) О.С. Моренковым, и еще 1 ч в TBST-буфере, содержащем 0.4% казеина и коньюгированные с пе-роксидазой хрена (КФ 1.11.1.7) кроличьи антитела против мышиных антител ("Fermentas", США). Затем мембрану проявляли, используя в качестве субстрата и хромогена пероксид водорода и 3,3'-диаминобензидин.
Получение гомогенного препарата инвертазы из КС C. utilis и ее частичное секвенирование. SEP-фракцию, экстрагиррованную, как указано ранее, из предварительно обработанных или необработанных трипсином КС, разделяли электрофоретически в 10%-ном ПААГ [15]. Затем проводили электроэлюцию из участка ПААГ, соответствующего зоне миграции белка с молеклярной массой 116 кДа. Далее полученный препарат диализова-ли, лиофильно высушивали и после перерастворения в 1.0 М аммоний бикарбонатном буфере, рН 7.8, проводили его ферментативный гидролиз (фермент : субстрат 1 : 100 по массе) с использованием ТРСК-трипсина ("Sigma" США). Реакцию проводили при 37°С в течение 6 ч. Аликвоты белка 1—5 мкг отбирали до и после реакции для оценки степени гидролиза. Реакцию останавливали добавлением ингибитора диизопропилфторфос-фата. Триптический гидролизат белка фракционировали методом ВЭЖХ в обращенной фазе на колонке Ultrashere С8, 250 х 4.6 мм ("Beckman", США) с использованием хроматографической системы "Beckman" в градиентном режиме. Для разделения использовали два элюента А и Б: элю-ент А представлял собой 0.1%-ный раствор три-фторуксусной кислоты в воде, элюент Б состоял из 0.1%-ного раствора трифторуксусной кислоты в ацетонитриле. Элюцию начинали элюентом А в течение 1 мин, далее использовали линейный градиент до 50% элюента Б в течение 60 мин, а затем линейный градиент до 60% элюента Б в течение 10 мин. Скорость потока составляла 1 мл/мин. Детектирование пептидов проводили по поглощению при 215 нм на многоканальном детекторе
PYE UNICAM PU 4021 ("Philips", Нидерланды). Пептидные фракции собирали при помощи коллектора фракций Model 201 ("Gilson", Франция) и в случае необходимости рехроматографирова-ли. Рехроматографию проводили на колонке Nu-cleosil C18, 2 х 75 мм ("Beckman", США) с использованием хроматографической системы. В выделенных гомогенных пептидах определяли аминокислотный состав, проводили масс-спек-трометрию и короткий сиквенс по Эдману [17]. N-концевой сиквенс пептидов проводили на се-квенаторе 475A "Applied Biosystem" (США). Аминокислотная последовательность проанализированных пептидов практически полностью совпадала (из 18 аминокислот не совпадала только одна: аспарагин был замещен на аспарагиновую кислоту), с соответствующими им аминокислотными последовательностями, входящими в состав инвертазы, экспортируемой
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.